TACI: 3D カルシウムイメージング解析のための ImageJ プラグイン
Summary
TrackMate カルシウムイメージング分析(TACI)は、z軸の動きを調べ、各zスタックの最大値を特定して、対応する時点での細胞の強度を表す、3Dカルシウムイメージング分析用のオープンソースのImageJプラグインです。横方向(x / y)方向に重なり合うが、異なるz平面上にあるニューロンを分離できます。
Abstract
神経科学の研究は、データセットから包括的な情報を抽出するために複雑なイメージングおよび計算ツールを使用するように進化しました。カルシウムイメージングは、信頼性の高い結果を得るために高度なソフトウェアを必要とする広く使用されている技術ですが、多くのラボは、最新の基準を満たすようにプロトコルを更新する際に計算方法を採用するのに苦労しています。プログラミングの知識とソフトウェアのペイウォールが不足しているために問題が発生します。さらに、目的の細胞は、カルシウムイメージング中にあらゆる方向の動きを示します。横方向(x / y)方向の動きを補正するために、多くのアプローチが開発されています。
この論文では、新しいImageJプラグインであるTrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI)を使用して、3Dカルシウムイメージングのz軸上の動きを調べるワークフローについて説明します。このソフトウェアは、ニューロンが現れるすべてのz位置から最大蛍光値を識別し、それを使用して対応するt位置でのニューロンの強度を表します。したがって、このツールは、横方向(x / y)方向に重なり合っているが、異なるz平面に現れるニューロンを分離できます。ImageJプラグインとして、TACIは3Dカルシウムイメージング分析のためのユーザーフレンドリーなオープンソースの計算ツールです。このワークフローは、温度変動時にあらゆる方向の動きを表示するハエの幼虫の熱感受性ニューロンと、ハエの脳から取得した3Dカルシウムイメージングデータセットを使用して検証しました。
Introduction
細胞内カルシウムのレベルは、ニューロンの興奮性の正確なマーカーです。カルシウムイメージングは、細胞内カルシウムの変化を測定して神経活動を理解する1。神経科学の研究は、遺伝的アプローチを通じて特定のニューロンセットで非侵襲的に発現することができるGCaMP 2,3などの遺伝的にコードされたカルシウム指示薬(GECI)を含む細胞内カルシウム濃度を測定するための技術の開発により、この方法をますます使用しています。レーザーと顕微鏡コンポーネントの低コスト化により、カルシウムイメージングの使用も増加しています4。重要なことに、カルシウムイメージングは、自由に動く動物において、単一のニューロンと大きなニューロン集団を同時に記録および研究することを可能にする5。
それにもかかわらず、カルシウム画像化データの分析は、(1)個々の細胞の蛍光の経時的な変化を追跡することを含み、(2)蛍光シグナルが断続的に消失するか、またはニューロン応答とともに再び現れること、および(3)ニューロンがあらゆる方向、特に焦点面に出入りするか、または複数の平面上に現れることがあるため、困難である4、6.手動分析は時間がかかり、記録の長さとニューロンの数が増えるにつれて実用的ではなくなります。カルシウムイメージングの分析プロセスを加速するために、さまざまなソフトウェアプログラムが開発されています。以前は、ソフトウェアは限られた実験コンテキストで設計されていたため、他の研究室がそれを採用することは困難でした。ソフトウェア共有に関する最新の基準を満たすための最近の取り組みにより、異なるグループ間でカルシウムイメージングデータを一貫して分析できるいくつかのツールが開発されました7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 .ただし、これらのツールのほとんどはプログラミングの知識を必要とするか、商用ソフトウェアに依存しています。プログラミングの知識とソフトウェアのペイウォールが不足しているため、研究者はこれらの方法を採用することを思いとどまらせています。さらに、これらのツールの多くはx/yモーションの補正に重点を置いていますが、z軸の動きも明示的に診断して修正する必要があります6。zドリフトを示し、複数のz平面に現れるニューロンに焦点を当てた3Dカルシウムイメージングを分析するための計算ツールが必要です。理想的には、このツールはオープンソースソフトウェアを使用し、他のラボが簡単に採用できるようにプログラミングの知識を必要としない必要があります。
ここでは、3Dカルシウムイメージングデータを解析するための新しいImageJプラグインTACIを開発しました。まず、ソフトウェアは必要に応じて名前を変更し、3Dカルシウムイメージングデータをz位置ごとに整理します。目的の細胞は各z位置で追跡され、その蛍光強度はTrackMateまたは他の計算ツールによって抽出されます。次に、TACIを適用してz軸上の動きを調べます。Z スタックの最大値を識別し、それを使用して、対応する時点でのセルの強度を表します。このワークフローは、すべての方向の動きや、横方向(x / y)方向に重なり合っているが異なるz位置に現れるニューロンを持つ3Dカルシウムイメージングの分析に適しています。このワークフローを検証するために、ハエの幼虫の熱感受性ニューロンと脳内のキノコニューロンからの3Dカルシウムイメージングデータセットを使用しました。注目すべきことに、TACIはオープンソースのImageJプラグインであり、プログラミングの知識は必要ありません。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、新しいImageJプラグインTACIを開発し、3Dカルシウムイメージングを解析するワークフローを記述した。現在利用可能な多くのツールは、x / yモーションの補正に重点を置いていますが、z軸の動きも明示的に診断または修正する必要があります6。生きている生物の画像取得中、生物が固定化されていてもz軸上の動きは避けられず、温度変化などの何らかの刺激が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フラリンイメージングセンターのツァイスLSM 880を使用して、カルシウムイメージングデータを収集しました。ミシェル・L・オルセン博士とユハン・パン博士のIMARISソフトウェアの支援に感謝します。原稿に対する建設的なコメントをしてくれたLenwood S. Heath博士と、GitHub READMEファイルへのコメントをくださったSteven Giavasisに感謝します。この作業は、NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) および NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) から L.N. までサポートされました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
