Summary

TACI: un plugin ImageJ per l'analisi 3D dell'imaging del calcio

Published: December 16, 2022
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Summary

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) è un plugin ImageJ open source per l’analisi 3D dell’imaging del calcio che esamina il movimento sull’asse z e identifica il valore massimo di ogni z-stack per rappresentare l’intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma su diversi piani z.

Abstract

La ricerca nelle neuroscienze si è evoluta per utilizzare complessi strumenti di imaging e computazionali per estrarre informazioni complete dai set di dati. L’imaging del calcio è una tecnica ampiamente utilizzata che richiede un software sofisticato per ottenere risultati affidabili, ma molti laboratori faticano ad adottare metodi computazionali quando aggiornano i protocolli per soddisfare gli standard moderni. Le difficoltà sorgono a causa della mancanza di conoscenze di programmazione e paywall per il software. Inoltre, le cellule di interesse mostrano movimenti in tutte le direzioni durante l’imaging del calcio. Sono stati sviluppati molti approcci per correggere il movimento nella direzione laterale (x/y).

Questo documento descrive un flusso di lavoro che utilizza un nuovo plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), per esaminare il movimento sull’asse z nell’imaging 3D del calcio. Questo software identifica il valore massimo di fluorescenza da tutte le posizioni z in cui appare un neurone e lo utilizza per rappresentare l’intensità del neurone nella posizione t corrispondente. Pertanto, questo strumento può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma appaiono su piani z distinti. Come plug-in ImageJ, TACI è uno strumento computazionale open source e facile da usare per l’analisi 3D dell’imaging del calcio. Abbiamo convalidato questo flusso di lavoro utilizzando neuroni termosensibili larvali di mosca che mostravano movimenti in tutte le direzioni durante la fluttuazione della temperatura e un set di dati di imaging del calcio 3D acquisito dal cervello del moscerino.

Introduction

Il livello di calcio intracellulare è un marcatore preciso di eccitabilità neuronale. L’imaging del calcio misura i cambiamenti nel calcio intracellulare per comprendere l’attività neuronale1. Gli studi nelle neuroscienze hanno sempre più utilizzato questo metodo a causa dello sviluppo di tecniche per misurare la concentrazione intracellulare di calcio, compresi gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP2,3, che possono essere espressi in modo non invasivo in specifici gruppi di neuroni attraverso approcci genetici. I minori costi dei laser e dei componenti del microscopio hanno anche aumentato l’uso dell’imaging del calcio4. È importante sottolineare che l’imaging del calcio consente di registrare e studiare contemporaneamente singoli neuroni e grandi popolazioni di neuroni in animali che si muovono liberamente5.

Tuttavia, l’analisi dei dati di imaging del calcio è impegnativa perché (1) comporta il monitoraggio dei cambiamenti nella fluorescenza delle singole cellule nel tempo, (2) il segnale di fluorescenza scompare o riappare in modo intermittente con risposte neuronali e (3) i neuroni possono muoversi in tutte le direzioni, in particolare dentro e fuori da un piano focale o apparire su più piani4, 6. L’analisi manuale richiede molto tempo e diventa poco pratica con l’aumentare della lunghezza delle registrazioni e del numero di neuroni. Sono stati sviluppati vari programmi software per accelerare il processo di analisi dell’imaging del calcio. In precedenza, il software era stato progettato in un contesto sperimentale limitato, rendendo difficile per altri laboratori adottarlo. I recenti sforzi per soddisfare i moderni standard per la condivisione del software hanno portato allo sviluppo di diversi strumenti in grado di analizzare costantemente i dati di imaging del calcio in diversi gruppi 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Tuttavia, la maggior parte di questi strumenti richiede conoscenze di programmazione e / o dipende da software commerciali. La mancanza di conoscenze di programmazione e paywall software scoraggiano i ricercatori dall’adottare questi metodi. Inoltre, molti di questi strumenti si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull’asse z debba essere esplicitamente diagnosticato e corretto6. C’è bisogno di uno strumento computazionale per analizzare l’imaging 3D del calcio che si concentra sui neuroni che mostrano z-drift e appaiono su più piani z. Idealmente, questo strumento dovrebbe utilizzare software open source e non richiedere conoscenze di programmazione per consentire ad altri laboratori di adottarlo prontamente.

Qui, abbiamo sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, per analizzare i dati di imaging 3D del calcio. Innanzitutto, il software rinomina, se necessario, e organizza i dati di imaging del calcio 3D per posizioni z. Le celle di interesse sono tracciate in ogni posizione z e le loro intensità di fluorescenza sono estratte da TrackMate o altri strumenti computazionali. TACI viene quindi applicato per esaminare il movimento sull’asse z. Identifica il valore massimo di uno z-stack e lo utilizza per rappresentare l’intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Questo flusso di lavoro è adatto all’analisi dell’imaging 3D del calcio con movimento in tutte le direzioni e / o con neuroni sovrapposti nella direzione laterale (x / y) ma che appaiono in diverse posizioni z. Per convalidare questo flusso di lavoro, sono stati utilizzati set di dati di imaging del calcio 3D da neuroni termosensibili larvali di mosca e neuroni di funghi nel cervello. Da notare che TACI è un plugin ImageJ open source e non richiede alcuna conoscenza di programmazione.

Protocol

1. Imaging del calcio Preparazione delle larve di moscaNOTA: Le mosche e le larve sono mantenute a 25 °C in un ciclo luce:buio di 12 ore:12 ore.Anestetizzare le mosche con CO2. Ordinare 20-45 maschi e 20-45 femmine in ogni fiala di mosca e dare loro almeno 24 ore a 48 ore per riprendersi dall’esposizione a CO2 .NOTA: L’esposizione della mosca alla CO2 dovrebbe durare per il minor tempo possibile. Per sincronizzare l’età delle larve, …

Representative Results

Flusso di lavoro di analisi 3D di imaging del calcioIn questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e descritto un flusso di lavoro per tracciare la deriva z e analizzare l’imaging 3D del calcio che individua le risposte delle singole cellule che appaiono in più posizioni z (Figura 1). Questo strumento ha quattro funzioni: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT e MERGE. Innanzitutto, se i nomi de…

Discussion

Questo studio ha sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e ha descritto un flusso di lavoro che analizza l’imaging 3D del calcio. Molti strumenti attualmente disponibili si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull’asse z debba essere esplicitamente diagnosticato o corretto6. Durante l’acquisizione di immagini in un organismo vivo, il movimento sull’asse z è inevitabile anche quando l’organismo è immobilizzato e alcuni stimoli, come il cambiamento di tempe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Uno Zeiss LSM 880 nel Fralin Imaging Center è stato utilizzato per raccogliere i dati di imaging del calcio. Ringraziamo la dottoressa Michelle L Olsen e Yuhang Pan per la loro assistenza con il software IMARIS. Riconosciamo il Dr. Lenwood S. Heath per i commenti costruttivi sul manoscritto e Steven Giavasis per i commenti sul file README di GitHub. Questo lavoro è stato supportato da NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) e NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Materials

Blunt Fill Needel BD 303129
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific  10035-04-8 Fly food ingredient
Carbon dioxide Airgas UN1013 Size 200 High Pressure Steel Cylinder
CO2 bubbler kit Genesee 59-180
Confocal microscope LSM880 Zeiss 4109002107876000 An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2.
DAQami software Measurement Computing
Dextrose Genesee 62-113 Fly food ingredient
Drosophila Agar Genesee 66-111 Fly food ingredient
Ethanol Decon Labs, Inc. 64-17-5 Fly food ingredient
Fly line: Ir21a-Gal4 Dr. Paul Garrity lab A kind gift
Fly line: Ir21a-Gal80 Dr. Lina Ni lab
Fly line: Ir68a-Gal4 Dr. Aravinthan DT Samuel lab A kind gift
Fly line: Ir93a-Gal4 Dr. Paul Garrity lab A kind gift
Fly line: UAS-GCaMP6 Bloomington Drosophila Stock Center 42750
Flypad Genesee 59-114
General purpose forged brass regulator Gentec G152
Gibco PBS pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-031
Green Drosophila tubing Genesee 59-124
Heat transfer compound MG Chemicals 860-60G
Heatsink Digi-Key Electronics ATS2193-ND Resize to 12.9 x 5.5 cm
Illuminator AmScope LED-6W
Inactive Dry Yeast Genesee 62-108 Fly food ingredient
Incubator Pervical DR-41VL Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH.
Methyl-4-hydroxybenzoate Thermo Scientific 126965000 Fly food ingrediete
Micro cover glass VWR  48382-126 22 x 40 mm
Microscope slides Fisher Scientific  12-544-2 25 x 75 x 1.0 mm
Nail polish Kleancolor
Narrow Drosophila vials Genesee 32-113RL
Objective  Zeiss 420852-9871-000 LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27
Peltier cooling module TE Technology TE-127-1.0-0.8 30 x 30 mm
Plugs Genesee 49-102
Power Supply Circuit Specialists CSI1802X 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply
Princeton Artist Brush Nepture Princeton Artist Brush Co. Series 4750, size 2
Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate Thermo Scientific 033241-36 Fly food ingredient
Stage insert  Wienecke and Sinske 432339-9030-000
Stereo Microscope Olympus SZ61 Any stereo microscope works
T-Fitting Genesee 59-123
Thermocouple data acquisition device Measurement Computing USB-2001-TC Single channel
Thermocouple microprobe Physitemp IT-24P 
Yellow Cornmeal Genesee 62-101 Fly food ingredient
Z-axis piezo stage Wienecke and Sinske 432339-9000-000

References

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Cite This Article
Omelchenko, A. A., Bai, H., Hussain, S., Tyrrell, J. J., Klein, M., Ni, L. TACI: An ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (190), e64953, doi:10.3791/64953 (2022).

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