Vi beskriver trinvise protokoller, der måler mitokondriel respiration af muse- og humane neutrofiler og HL60-celler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator.
Neutrofiler er den første forsvarslinje og de mest rigelige leukocytter hos mennesker. Disse effektorceller udfører funktioner såsom fagocytose og oxidativ burst og skaber neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) til mikrobiel clearance. Ny indsigt i neutrofilers metaboliske aktiviteter udfordrer det tidlige koncept, at de primært er afhængige af glykolyse. Præcis måling af metaboliske aktiviteter kan udfolde forskellige metaboliske krav til neutrofiler, herunder tricarboxylsyre (TCA) cyklus (også kendt som Krebs cyklus), oxidativ phosphorylering (OXPHOS), pentosephosphatvej (PPP) og fedtsyreoxidation (FAO) under fysiologiske forhold og i sygdomstilstande. Dette papir beskriver en trinvis protokol og forudsætninger for at måle iltforbrugshastigheden (OCR) som en indikator for mitokondriel respiration på museknoglemarvsafledte neutrofiler, humane blodafledte neutrofiler og den neutrofillignende HL60-cellelinje ved hjælp af metabolisk fluxanalyse på en metabolisk ekstracellulær fluxanalysator. Denne metode kan anvendes til kvantificering af mitokondriefunktionerne hos neutrofiler under normale og sygdomsbetingelser.
Mitokondrier spiller en vigtig rolle i cellebioenergetik, som genererer adenosintrifosfat (ATP) ved oxidativ phosphorylering (OXPHOS). Ud over dette strækker mitokondriernes rolle sig ind i generering og afgiftning af reaktive iltarter, cytoplasmatisk og mitokondriel matrixcalciumregulering, cellulær syntese, katabolisme og transport af metabolitter i cellen1. Mitokondriel respiration er afgørende i alle celler, da deres dysfunktion kan resultere i metaboliske problemer 2, herunder hjerte-kar-sygdomme3 og en lang række neurodegenerative sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration4, Parkinsons og Alzheimers sygdomme5 og Charcot-Marie-Tooth sygdom2 A (CMT2A)6.
Elektronmikroskopiske undersøgelser af neutrofiler afslørede, at der er relativt få mitokondrier7, og de er stærkt afhængige af glykolyse for deres energiproduktion, da mitokondrie respirationshastigheder er meget lave8. Imidlertid er mitokondrier afgørende for neutrofile funktioner, såsom kemotakse9 og apoptose10,11,12. En tidligere undersøgelse afslørede et komplekst mitokondrienetværk i humane neutrofiler med højt membranpotentiale. Mitokondriemembranens potentielle tab er en tidlig indikator for neutrofil apoptose10. Behandling med mitokondriel afkobler carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP) viste signifikant hæmning i kemotaksi sammen med en ændring i mitokondriemorfologi 9,10.
Selvom den primære energikilde for neutrofiler er glykolyse, tilvejebringer mitokondrier ATP, der initierer neutrofilaktivering ved at brænde den første fase af purinerg signalering, hvilket øger Ca2+ signalering, forstærker mitokondriel ATP-produktion og initierer neutrofile funktionelle reaktioner13. Dysfunktion af mitokondrie-respirationskæden resulterer i overdreven produktion af toksiske reaktive iltarter (ROS) og fører til patogene skader14,15,16. NETosis, som er processen med at danne neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er), er en kritisk egenskab ved neutrofiler, der hjælper dem med at bekæmpe patogener17 og bidrager til mange patologiske tilstande, herunder kræft, trombose og autoimmune lidelser18. Mitokondrieafledt ROS bidrager til NETosis19, mitokondrie-DNA kan være en komponent i NETs18, og ændret mitokondriehomeostase svækker NETosis 20,21,22,23,24. Desuden bliver neutrofil metabolisk omprogrammering under normal differentiering eller modning vendt ved at begrænse glykolytisk aktivitet, og de engagerer sig i mitokondriel respiration og mobiliserer intracellulære lipider25,26.
Den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator kan kontinuerligt overvåge og kvantificere levende celle mitokondriel respiration og glykolyse. Analysatoren anvender en 96-brønds pladeformatsensorpatron og to fluoroforer til at kvantificere iltkoncentration (O2) og pH-ændringer. Sensorpatronen er over cellemonolaget under analysen og danner et ~ 200 nm højt mikrokammer. De optiske fiberbundter i analysatoren bruges til at excitere fluoroforerne og detektere de fluorescerende intensitetsændringer. Ændringer i realtid iO2-koncentration og pH beregnes automatisk og vises som iltforbrugshastighed (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR). Der er fire porte på sensorpatronen, der gør det muligt at indlæse op til fire forbindelser i hver brønd under analysemålingerne. Denne protokol fokuserer på kvantificering af mitokondriel respiration af mus og humane neutrofiler samt de neutrofillignende HL60-celler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator.
Standardproceduren, der måler mitokondriel respiration af neutrofiler ved hjælp af den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator, er begrænset af mange faktorer, herunder celleantal, cellevækst og levedygtighed. Hver sammensat koncentration varierer mellem typen og kilden til celler i dette assay. Oligomycin og rotenon/antimycin A anvendes mest i en lignende koncentration blandt de fleste celletyper. Da den FCCP-inducerede maksimale respirationsfrekvens varierer mellem forskellige celler, kræves der imidlertid om…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Dr. Anthony T. Vella og Dr. Federica Aglianoin fra Institut for Immunologi ved UConn Health for deres træning i at bruge den metaboliske ekstracellulære fluxanalysator og Dr. Lynn Puddington i Institut for Immunologi ved UConn Health for hendes støtte til instrumenterne. Vi anerkender Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for hendes hjælp med videnskabelig skrivning og redigering af dette manuskript. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 og P20GM139763), en opstartsfond fra UConn Health og et karriere-genindrejsestipendium fra American Association of Immunologer.
37 °C non-CO2 incubator | Precision | Economy Model 2EG | Instrument |
Biorender | Software Application | ||
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 102416-100 | Reagent |
EasySep Magnet | STEMCELL | 18000 | Magnet |
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit | STEMCELL | 19762A | Reagents |
Graphpad Prism 9 | Software Application | ||
Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
Ketamine (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | Anesthetic |
PBS | Cytiva | SH30256.01 | Reagents |
Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | polysaccharide solution |
Purified mouse anti-human CD18 antibody | Biolegend | 302102 | Clone TS1/18 |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11-875-093 | Reagents |
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer | Agilent | XFe96 | Instrument |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | mitochondrial stress test Kit |
Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
Vactrap 2 Vacum Trap | Fox Lifesciences | 3052101-FLS | Instrument |
Wave | Software Application | ||
XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent | 103577-100 | Reagent |
XF 100 mM Pyruvate Solution | Agilent | 103578-100 | Reagent |
XF 200 mM Glutamine Solution | Agilent | 103579-100 | Reagent |
XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | Reagent |
XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Material |
Xylazine (AnaSed Injection) | DAILYMED | NDC 59399-110-20 | Anesthetic |