대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
호중구는 인간의 첫 번째 방어선이자 가장 풍부한 백혈구입니다. 이러한 이펙터 세포는 식균 작용 및 산화 버스트와 같은 기능을 수행하고 미생물 제거를 위한 호중구 세포외 트랩(NET)을 생성합니다. 호중구의 대사 활동에 대한 새로운 통찰력은 호중구가 주로 해당과정에 의존한다는 초기 개념에 도전합니다. 대사 활동의 정확한 측정은 트리카르복실산(TCA) 회로(크렙스 회로라고도 함), 산화적 인산화(OXPHOS), 오탄당 인산염 경로(PPP) 및 지방산 산화(FAO)를 포함하여 호중구의 다양한 대사 요구 사항을 밝힐 수 있습니다. 이 논문은 대사 세포외 플럭스 분석기에서 대사 플럭스 분석을 사용하여 마우스 골수 유래 호중구, 인간 혈액 유래 호중구 및 호중구 유사 HL60 세포주에서 미토콘드리아 호흡의 지표로 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 단계별 프로토콜 및 사전 요구 사항을 설명합니다. 이 방법은 정상 및 질병 조건 하에서 호중구의 미토콘드리아 기능을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
미토콘드리아는 산화적 인산화(OXPHOS)에 의해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하는 세포 생물 에너지학에서 중요한 역할을 합니다. 이 외에도 미토콘드리아의 역할은 활성 산소 종의 생성 및 해독, 세포질 및 미토콘드리아 기질 칼슘 조절, 세포 합성, 이화 작용 및 세포 내 대사 산물의 수송으로 확장됩니다1. 미토콘드리아 호흡은 모든 세포에 필수적인데, 그 기능 장애는 심혈관 질환3과 연령 관련 황반변성4, 파킨슨병 및 알츠하이머병5, 샤르코-마리-투스병2 A(CMT2A)6와 같은 다양한 신경퇴행성 질환을 포함한 대사 문제2를 유발할 수 있기 때문이다.
호중구에 대한 전자 현미경 연구에 따르면 미토콘드리아는 상대적으로 적으며7 미토콘드리아는 미토콘드리아 호흡률이 매우 낮기 때문에 에너지 생산을 위해 해당과정에 크게 의존하고 있다8. 그러나 미토콘드리아는 화학주성9 ....
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프로토콜
헤파린화된 전혈 샘플은 헬싱키 선언에 따라 UConn Health의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board of UConn Health)의 승인을 받은 정보에 입각한 동의를 얻은 후 건강한 인간 기증자로부터 얻었습니다. 모든 동물 실험은 UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC) 가이드라인을 따랐으며, 설치류 사용에 대한 승인은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 요약된 기준에 따라 UConn Health IACUC로부터 획득되었습니다. 6주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 본 연구에 사용하였다.
1. 대사세포외 플럭스 분석을 위한 96-웰 플레이트의 제조
- 센서 카트리지는 대사 세포외 플럭스 분석을 위해 특별히 설계된 96웰 플레이트 위에 포장되어 있습니다. 카트리지를 조심스럽게 들어 올려 수화하고 200μL/웰의 교정 배지를 기본 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 카트리지를 보정제가 있는 플레이트 위에 놓고 비CO2, 가습, 37°C 인큐베이터에서 밤새 수....
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결과
마우스 호중구(도 3A), 인간 호중구(도 3B) 및 미분화 및 분화된 HL60 세포(도 3C)의 혼합물의 올리고마이신, FCCP 및 로테논/안티마이신 A에 대한 반응으로 미토콘드리아 호흡 변화를 나타내는 대표적인 OCR 동역학이 도시된다. 모든 세포에서, 올리고마이신 처리는 ATP 합성효소의 양성자 채널을 억제함으로써 OCR 값을 감소시키고; FCCP 치료는 전자의 흐름과 산소 소비를 증가시켜 막 전위를 유지하고 최대 호흡을 달성함으로써 OCR 값을 복원합니다. 로테논/안티마이신 A 혼합물 처리는 전자 수송 사슬의 복합체 I 및 III을 차단하여 미토콘드리아 호흡을 제거합니다.
우리는 호중구 유도 분화 후 HL60 세포가 미토콘드리아 호흡이 감소한 것을 관찰했습니다(그림 3C
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토론
대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 호중구의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 표준 절차는 세포 수, 세포 성장 및 생존력을 포함한 많은 요인에 의해 제한됩니다. 각 화합물 농도는 이 분석에서 세포의 유형과 공급원에 따라 다릅니다. 올리고마이신과 로테논/안티마이신 A는 대부분의 세포 유형에서 비슷한 농도로 주로 사용됩니다. 그러나, FCCP에 의해 유도된 최대 호흡수는 상이한 세포들 사이에서 다르기 때문에, 농도를 최적화하기 위해서는 FCCP의 신중한 적정이 요구된다(42). 또한 최적화 중에 FCCP를 순차적으로 추가하는 것이 좋습니다. 대사 세포외 플럭스 분석기가 기압(43) 하에서 플레이트 내로 약물을 주입하지만, 일부 미토콘드리아 복합체 억제제에 대한 세포막의 불투과성은 단리된 미토콘드리아(44)와 비교하여 온전한 세포의 경우 이들의 사용을 제한한다. 교차 오염을 피하기 위해 포트에 적재하는 것은 .......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
대사 세포외 플럭스 분석기 사용에 대한 교육을 제공한 UConn Health 면역학과의 Anthony T. Vella 박사와 Federica Aglianoin 박사, 기기를 지원해 주신 UConn Health 면역학과의 Lynn Puddington 박사에게 감사드립니다. 이 원고의 과학적 저술 및 편집에 도움을 준 UConn School of Medicine의 Geneva Hargis 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health), 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (National Heart, Lung, and Blood Institute, R01HL145454), 국립 일반 의학 연구소 (National Institute of General Medical Sciences, R35GM147713 and P20GM139763), UConn Health의 창업 기금 및 미국 면역 학자 협회 (American Association of Immunologists)의 경력 재진입 펠로우쉽.
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재료
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| EasySepMouse 호중구 농축 키트 | STEMCELL | 19762A | 시약 |
| Graphpad Prism 9 | 소프트웨어 응용 프로그램 | ||
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| 케타민 (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | 마취 |
| PBS | Cytiva | SH30256.01 | 시약 |
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| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (이전 1114683) | 다당류 용액 |
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| XF DMEM 배지 | Agilent | 103575-100 | 시약 |
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참고문헌
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
- Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation....
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