हम चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके माउस और मानव न्यूट्रोफिल और एचएल 60 कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने वाले चरणबद्ध प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
न्यूट्रोफिल रक्षा की पहली पंक्ति है और मनुष्यों में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं। ये प्रभावक कोशिकाएं फागोसाइटोसिस और ऑक्सीडेटिव विस्फोट जैसे कार्य करती हैं, और माइक्रोबियल निकासी के लिए न्यूट्रोफिल बाह्य कोशिकीय जाल (एनईटी) बनाती हैं। न्यूट्रोफिल की चयापचय गतिविधियों में नई अंतर्दृष्टि प्रारंभिक अवधारणा को चुनौती देती है कि वे मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करते हैं। चयापचय गतिविधियों का सटीक माप न्यूट्रोफिल की विभिन्न चयापचय आवश्यकताओं को प्रकट कर सकता है, जिसमें ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड (टीसीए) चक्र (जिसे क्रेब्स चक्र के रूप में भी जाना जाता है), ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीएचओ), पेंटोस फॉस्फेट मार्ग (पीपीपी), और फैटी एसिड ऑक्सीकरण (एफएओ) शारीरिक परिस्थितियों में और रोग अवस्थाओं में शामिल हैं। यह पेपर एक चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक पर चयापचय प्रवाह विश्लेषण का उपयोग करते हुए, माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल, मानव रक्त-व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल और न्यूट्रोफिल जैसी एचएल 60 सेल लाइन पर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के संकेतक के रूप में ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) को मापने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल और पूर्वआवश्यकताओं का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग सामान्य और रोग स्थितियों के तहत न्यूट्रोफिल के माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।
माइटोकॉन्ड्रिया सेल बायोएनर्जेटिक में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीओएस) द्वारा एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पन्न करता है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, साइटोप्लाज्मिक और माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स कैल्शियम विनियमन, सेलुलर संश्लेषण, अपचय और सेल1 के भीतर मेटाबोलाइट्स के परिवहन के उत्पादन और विषहरण में फैली हुई है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सभी कोशिकाओं में आवश्यक है, क्योंकि उनकी शिथिलता के परिणामस्वरूप चयापचय संबंधी समस्याएंहो सकती हैं2, जिसमें हृदय रोग3 और विभिन्न प्रकार के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग शामिल हैं, जैसे कि उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन4, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग5, और चारकोट-मैरी-टूथ रोग 2 ए (सीएमटी 2 ए)6।
न्यूट्रोफिल पर इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अध्ययन से पता चला है कि अपेक्षाकृत कम माइटोकॉन्ड्रिया7 हैं, और वे अपने ऊर्जा उत्पादन के लिए ग्लाइकोलाइसिस पर बहुत अधिक निर्भर करते हैं क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दरबहुत कम है। हालांकि, न्यूट्रोफिल कार्यों के लिए माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि केमोटैक्सिस9 और एपोप्टोसिस10,11,12। एक पिछले अध्ययन में उच्च झिल्ली क्षमता वाले मानव न्यूट्रोफिल में एक जटिल माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का पता चला। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित हानि न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस10 का एक प्रारंभिक संकेतक है। माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी) के साथ उपचार ने माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान 9,10 में बदलाव के साथ-साथ केमोटैक्सिस में महत्वपूर्ण अवरोध दिखाया।
यद्यपि न्यूट्रोफिल के लिए प्राथमिक ऊर्जा स्रोत ग्लाइकोलाइसिस है, माइटोकॉन्ड्रिया एटीपी प्रदान करता है जो प्यूरीनर्जिक सिग्नलिंग के पहले चरण को ईंधन देकर न्यूट्रोफिल सक्रियण शुरू करता है, जो सीए2 + सिग्नलिंग को बढ़ाता है, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन को बढ़ाता है, और न्यूट्रोफिलकार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को शुरू करता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला की शिथिलता के परिणामस्वरूप विषाक्त प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का अत्यधिक उत्पादन होता है और रोगजनक क्षति14,15,16 की ओर जाता है। एनईटोसिस, जो न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) बनाने की प्रक्रिया है, न्यूट्रोफिल की एक महत्वपूर्ण संपत्ति है जो उन्हें रोगजनकों17 से लड़ने में मदद करती है और कैंसर, घनास्त्रता और ऑटोइम्यूनविकारों सहित कई रोग स्थितियों में योगदान देती है। माइटोकॉन्ड्रियल-व्युत्पन्न आरओएस एनईटोसिस19 में योगदान देता है, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए एनईटी18 का एक घटक हो सकता है, और परिवर्तित माइटोकॉन्ड्रियल होमियोस्टैसिस एनईटोसिस20,21,22,23,24 को बाधित करता है। इसके अलावा, सामान्य भेदभाव या परिपक्वता के दौरान, न्यूट्रोफिल चयापचय रीप्रोग्रामिंग ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि को सीमित करके उलट हो जाती है, और वे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में संलग्न होते हैं और इंट्रासेल्युलर लिपिड25,26 जुटाते हैं।
चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक लगातार लाइव सेल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस की निगरानी और मात्रा निर्धारित कर सकता है। विश्लेषक ऑक्सीजन (ओ2) एकाग्रता और पीएच परिवर्तनों को मापने के लिए 96-वेल प्लेट प्रारूप सेंसर कारतूस और दो फ्लोरोफोर का उपयोग करता है। सेंसर कारतूस परख के दौरान सेल मोनोलेयर के ऊपर है और ~ 200 एनएम उच्च माइक्रोचैंबर बनाता है। विश्लेषक में ऑप्टिकल फाइबर बंडलों का उपयोग फ्लोरोफोरेस को उत्तेजित करने और फ्लोरोसेंट तीव्रता परिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया जाता है। ओ2 एकाग्रता और पीएच में वास्तविक समय परिवर्तन स्वचालित रूप से गणना की जाती है और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) के रूप में दिखाई जाती है। सेंसर कारतूस पर चार पोर्ट हैं जो परख माप के दौरान प्रत्येक कुएं में चार यौगिकों को लोड करने की अनुमति देते हैं। यह प्रोटोकॉल चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके माउस और मानव न्यूट्रोफिल के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के साथ-साथ न्यूट्रोफिल जैसी एचएल 60 कोशिकाओं को निर्धारित करने पर केंद्रित है।
मानक प्रक्रिया जो चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके न्यूट्रोफिल के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापती है, सेल संख्या, कोशिका वृद्धि और व्यवहार्यता सहित कई कारकों द्वारा सीमित है। प्रत्येक यौग?…
The authors have nothing to disclose.
हम यूकॉन हेल्थ में इम्यूनोलॉजी विभाग से डॉ एंथनी टी वेला और डॉ फेडेरिका एग्लियानिन को चयापचय बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करने में उनके प्रशिक्षण के लिए और यूकॉन हेल्थ में इम्यूनोलॉजी विभाग में डॉ लिन पुडिंगटन को उपकरणों के समर्थन के लिए स्वीकार करते हैं। हम इस पांडुलिपि के वैज्ञानिक लेखन और संपादन में मदद के लिए यूकॉन स्कूल ऑफ मेडिसिन से डॉ जिनेवा हारजिस को स्वीकार करते हैं। इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल हार्ट, लंग एंड ब्लड इंस्टीट्यूट (R01HL145454), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (R35GM147713 और P20GM139763), यूकॉन हेल्थ से एक स्टार्टअप फंड और अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ इम्यूनोलॉजिस्ट से करियर री-एंट्री फैलोशिप से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
37 °C non-CO2 incubator | Precision | Economy Model 2EG | Instrument |
Biorender | Software Application | ||
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 102416-100 | Reagent |
EasySep Magnet | STEMCELL | 18000 | Magnet |
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit | STEMCELL | 19762A | Reagents |
Graphpad Prism 9 | Software Application | ||
Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
Ketamine (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | Anesthetic |
PBS | Cytiva | SH30256.01 | Reagents |
Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | polysaccharide solution |
Purified mouse anti-human CD18 antibody | Biolegend | 302102 | Clone TS1/18 |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11-875-093 | Reagents |
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer | Agilent | XFe96 | Instrument |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | mitochondrial stress test Kit |
Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
Vactrap 2 Vacum Trap | Fox Lifesciences | 3052101-FLS | Instrument |
Wave | Software Application | ||
XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent | 103577-100 | Reagent |
XF 100 mM Pyruvate Solution | Agilent | 103578-100 | Reagent |
XF 200 mM Glutamine Solution | Agilent | 103579-100 | Reagent |
XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | Reagent |
XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Material |
Xylazine (AnaSed Injection) | DAILYMED | NDC 59399-110-20 | Anesthetic |