Vi beskriver trinnvise protokoller som måler mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler og HL60-celler ved hjelp av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator.
Neutrofiler er den første forsvarslinjen og de rikeste leukocytter hos mennesker. Disse effektorcellene utfører funksjoner som fagocytose og oksidativt utbrudd, og skaper nøytrofile ekstracellulære feller (NET) for mikrobiell clearance. Ny innsikt i nøytrofilenes metabolske aktiviteter utfordrer det tidlige konseptet om at de primært er avhengige av glykolyse. Nøyaktig måling av metabolske aktiviteter kan utfolde forskjellige metabolske krav til nøytrofiler, inkludert trikarboksylsyre (TCA) -syklusen (også kjent som Krebs-syklusen), oksidativ fosforylering (OXPHOS), pentosefosfatvei (PPP) og fettsyreoksidasjon (FAO) under fysiologiske forhold og sykdomstilstander. Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll og forutsetninger for å måle oksygenforbrukshastighet (OCR) som en indikator på mitokondriell respirasjon på nøytrofiler fra benmarg fra mus, humane blodavledede nøytrofiler og den nøytrofillignende HL60-cellelinjen, ved bruk av metabolsk fluksanalyse på en metabolsk ekstracellulær fluksanalysator. Denne metoden kan brukes til å kvantifisere mitokondrielle funksjoner av nøytrofiler under normale og sykdomsforhold.
Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellebioenergetikk, som genererer adenosintrifosfat (ATP) ved oksidativ fosforylering (OXPHOS). I tillegg til dette strekker mitokondriens rolle seg inn i generering og avgiftning av reaktive oksygenarter, cytoplasmatisk og mitokondriell matrikskalsiumregulering, cellulær syntese, katabolisme og transport av metabolitter i cellen1. Mitokondriell respirasjon er viktig i alle celler, da deres dysfunksjon kan resultere i metabolske problemer 2, inkludert kardiovaskulære sykdommer3 og et bredt spekter av nevrodegenerative sykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon4, Parkinsons og Alzheimers sykdommer5 og Charcot-Marie-Tooth sykdom2 A (CMT2A) 6.
Elektronmikroskopiske studier på nøytrofiler viste at det er relativt få mitokondrier7, og de er avhengige av glykolyse for energiproduksjonen, da mitokondriell respirasjonsfrekvens er svært lav8. Imidlertid er mitokondrier avgjørende for nøytrofile funksjoner, som kjemotaksis9 og apoptose10,11,12. En tidligere studie avslørte et komplekst mitokondrielt nettverk i humane nøytrofiler med høyt membranpotensial. Mitokondriemembranens potensielle tap er en tidlig indikator på nøytrofil apoptose10. Behandling med mitokondriell utkobling av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) viste signifikant hemming i kjemotaksis, sammen med endring i mitokondriell morfologi 9,10.
Selv om den primære energikilden for nøytrofiler er glykolyse, gir mitokondrier ATP som initierer nøytrofil aktivering ved å brenne den første fasen av purinerg signalering, noe som øker Ca2 + -signalering, forsterker mitokondriell ATP-produksjon og initierer nøytrofile funksjonelle responser13. Dysfunksjon av mitokondrie-respirasjonskjeden resulterer i overdreven produksjon av giftige reaktive oksygenarter (ROS) og fører til patogene skader14,15,16. NETosis, som er prosessen med å danne nøytrofile ekstracellulære feller (NET), er en kritisk egenskap hos nøytrofiler som hjelper dem med å bekjempe patogener17 og bidrar til mange patologiske forhold, inkludert kreft, trombose og autoimmune lidelser18. Mitokondrie-avledet ROS bidrar til NETosis19, mitokondrielt DNA kan være en komponent i NET18, og endret mitokondriell homeostase svekker NETosis 20,21,22,23,24. Videre, under normal differensiering eller modning, blir nøytrofil metabolsk omprogrammering reversert ved å begrense glykolytisk aktivitet, og de engasjerer seg i mitokondriell respirasjon og mobiliserer intracellulære lipider25,26.
Den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren kan kontinuerlig overvåke og kvantifisere levende celle mitokondriell respirasjon og glykolyse. Analysatoren benytter en 96-brønns plateformat sensorpatron og to fluoroforer for å kvantifisere oksygenkonsentrasjon (O2) og pH-endringer. Sensorpatronen er over cellemonolaget under analysen og danner et ~ 200 nm høyt mikrokammer. De optiske fiberbuntene i analysatoren brukes til å opphisse fluoroforene og oppdage fluorescerende intensitetsendringer. Sanntidsendringer iO2-konsentrasjon og pH beregnes automatisk og vises som oksygenforbrukshastighet (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR). Det er fire porter på sensorkassetten som tillater lasting av opptil fire forbindelser i hver brønn under analysemålingene. Denne protokollen fokuserer på å kvantifisere mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler, samt de nøytrofillignende HL60-cellene, ved hjelp av den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren.
Standardprosedyren som måler mitokondriell respirasjon av nøytrofiler ved hjelp av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator er begrenset av mange faktorer, inkludert celleantall, cellevekst og levedyktighet. Hver sammensatt konsentrasjon varierer mellom type og kilde til celler i denne analysen. Oligomycin og rotenon/antimycin A brukes mest i en lignende konsentrasjon blant de fleste celletyper. Siden FCCP-indusert maksimal respirasjonsfrekvens varierer mellom forskjellige celler, er det imidlertid nødvendig med for…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Dr. Anthony T. Vella og Dr. Federica Aglianoin fra Institutt for immunologi ved UConn Health for deres opplæring i bruk av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator, og Dr. Lynn Puddington i Institutt for immunologi ved UConn Health for hennes støtte til instrumentene. Vi anerkjenner Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for hennes hjelp med vitenskapelig skriving og redigering av dette manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 og P20GM139763), et oppstartsfond fra UConn Health og et karrierestipend fra American Association of Immunologs.
37 °C non-CO2 incubator | Precision | Economy Model 2EG | Instrument |
Biorender | Software Application | ||
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 102416-100 | Reagent |
EasySep Magnet | STEMCELL | 18000 | Magnet |
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit | STEMCELL | 19762A | Reagents |
Graphpad Prism 9 | Software Application | ||
Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
Ketamine (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | Anesthetic |
PBS | Cytiva | SH30256.01 | Reagents |
Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | polysaccharide solution |
Purified mouse anti-human CD18 antibody | Biolegend | 302102 | Clone TS1/18 |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11-875-093 | Reagents |
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer | Agilent | XFe96 | Instrument |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | mitochondrial stress test Kit |
Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
Vactrap 2 Vacum Trap | Fox Lifesciences | 3052101-FLS | Instrument |
Wave | Software Application | ||
XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent | 103577-100 | Reagent |
XF 100 mM Pyruvate Solution | Agilent | 103578-100 | Reagent |
XF 200 mM Glutamine Solution | Agilent | 103579-100 | Reagent |
XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | Reagent |
XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Material |
Xylazine (AnaSed Injection) | DAILYMED | NDC 59399-110-20 | Anesthetic |