تحليل تكلس الأوعية الدموية بوساطة الحويصلة خارج الخلية باستخدام نماذج في المختبر وفي الجسم الحي
Summary
يقدم هذا البحث منهجية الحصول على تكلس الأوعية الدموية وتقييمه عن طريق عزل أورتا الفئران متبوعا باستخراج الحويصلات خارج الخلية المتكلسة لمراقبة إمكانات التمعدن.
Abstract
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم ، وتكلس الأوعية الدموية هو أهم مؤشر على أحداث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا أي علاج أو خيارات علاجية لتكلس الأوعية الدموية. يبدأ التكلس داخل الحويصلات المتخصصة خارج الخلية (EVs) ، والتي تعمل كبؤر نواة عن طريق تجميع أيونات الكالسيوم والفوسفات. يصف هذا البروتوكول طرق الحصول على التكلس وتقييمه في أورتا الفئران وتحليل المركبات الكهربائية المستخرجة المرتبطة بها. أولا ، يتم إجراء تشريح إجمالي للفأر لجمع أي أعضاء ذات صلة ، مثل الكلى والكبد والرئتين. بعد ذلك ، يتم عزل الشريان الأورطي للفأر واستئصاله من جذر الأبهر إلى الشريان الفخذي. ثم يتم تجميع اثنين إلى ثلاثة من الأورتا وتحضينها في محلول هضمي قبل الخضوع للطرد المركزي الفائق لعزل المركبات الكهربائية ذات الأهمية. بعد ذلك ، يتم تحديد إمكانات التمعدن للمركبات الكهربائية من خلال الحضانة في محلول عالي الفوسفات وقياس امتصاص الضوء بطول موجي يبلغ 340 نانومتر. أخيرا ، يتم استخدام الهلاميات المائية الكولاجين لمراقبة تكوين المعادن المتكلسة والنضج الناتج عن المركبات الكهربائية في المختبر.
Introduction
التكلس هو أهم مؤشر على الوفيات والمراضة الناجمة عن أمراض القلب والأوعية الدموية1. يغير التكلس ميكانيكا جدار الشرايين بسبب تراكم معادن الكالسيوم والفوسفات2. في تصلب الشرايين ، يمكن أن يؤدي التكلس إلى تفاقم الإجهاد المحلي ويؤدي إلى تمزق البلاك ، وهو السبب الرئيسي للنوبات القلبية. التكلس الإنسي – الناتج غالبا عن مرض الكلى المزمن – أكثر انتشارا ويؤدي إلى تصلب الشرايين بشكل كبير ، واختلال وظيفي ، والحمل الزائد للقلب 2,3. حاليا ، لا توجد خيارات علاجية لعلاج أو الوقاية من تكلس الأوعية الدموية.
تتبنى خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) نمطا ظاهريا يشبه بانيات العظم وتطلق حويصلات خارج الخلية متكلسة (EVs) تعمل على نواة المعادن الوليدة ، مما يؤدي إلى تكلس4،5،6. تشبه هذه العملية التمعدن الفسيولوجي لبانيات العظم في العظام7. على الرغم من أن نقطة نهاية التمعدن متشابهة في جدار الأوعية الدموية ومصفوفة العظام ، إلا أن الآليات التي تنشأ بها EVs المتكلسة تختلف في النسجين8. هناك العديد من أنواع النماذج التي تستخدم لدراسة تكلس الأوعية الدموية. في المختبر ، تحاكي نماذج زراعة الخلايا الانتقال العظمي ل VSMCs والتكوين المعدني اللاحق مع وسائط متخصصة.
عند دراسة التكلس في الجسم الحي ، يعتمد النموذج المستخدم على نوع التكلس الذي تتم دراسته. غالبا ما تستخدم نماذج الفئران المفرطة شحميات الدم لدراسة تكلس تصلب الشرايين ، والذي يبدو أكثر تركيزا داخل اللويحات الغنية بالدهون9. في المقابل ، يكون التكلس الإنسي أكثر انتشارا في جميع أنحاء الأوعية الدموية وغالبا ما تتم دراسته باستخدام نماذج أمراض الكلى المزمنة التي تستخدم نظام غذائي غني بالأدينين للحث على الفشل الكلوي أو التقنيات الجراحية لإزالة أجزاء كبيرة من الكلى10,11. استخدمت النماذج العدوانية لتكلس الأوعية الدموية مزيجا من نماذج أمراض الكلى المفرطة في شحميات الدموالمزمنة 12. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتقييم تكلس الأوعية الدموية في أورتا الفئران لكل من التكلس الإنسي وتصلب الشرايين ، واستخراج EVs من جدار الأبهر ، ومراقبة إمكانات التمعدن في EVs التي تم الحصول عليها من نماذج زراعة الخلايا في المختبر. يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذه الإجراءات في التحليلات الميكانيكية لتكلس الأوعية الدموية وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند تنفيذ البروتوكول ، من المهم ملاحظة الخطوات الحاسمة للحصول على نتائج ناجحة. أثناء عزل الشريان الأورطي للفأر ، من الضروري إجراء التروية بشكل صحيح. عند حقن برنامج تلفزيوني ، يجب الحرص على عدم ثقب البطين الأيمن. هذا من شأنه أن يتسبب في تسرب السائل مباشرة من البطين ويفشل في الدوران عبر الرئ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) (1R01HL160740 و 5 T32GM132054-04) ومؤسسة فلوريدا لأبحاث القلب. نود أن نشكر كاساندرا غوميز على مساعدتها في تصنيع وتصوير الهلاميات المائية.
Materials
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
- Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
- Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
- Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
- Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
- New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
- Aikawa, E., Hutcheson, J. D. . Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).
- Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
- Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
- El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
- Veseli, B. E., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
- Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).
