גירוי רב-מודאלי אוטומטי והקלטה עצבית סימולטנית מאורגניזמים קטנים מרובים
Summary
אנו מציגים שיטה לגירוי כימי גמיש ורב-מודאלי ורישום של פעילות עצבית בו זמנית מתולעים רבות של Caenorhabditis elegans . שיטה זו משתמשת במיקרופלואידיקה, חומרה ותוכנה בקוד פתוח, וניתוח נתונים אוטומטי מפוקח כדי לאפשר מדידה של תופעות עצביות כגון הסתגלות, עיכוב זמני וגירוי crosstalk.
Abstract
מדדי סידן פלואורסצנטיים המקודדים גנטית תרמו רבות להבנתנו את הדינמיקה העצבית מרמת תאי עצב בודדים ועד למעגלים שלמים במוח. עם זאת, תגובות עצביות עשויות להשתנות עקב ניסיון קודם, מצבים פנימיים או גורמים סטוכסטיים, ובכך ליצור את הצורך בשיטות שיכולות להעריך תפקוד עצבי אצל אנשים רבים בבת אחת. בעוד שרוב טכניקות ההקלטה בוחנות חיה אחת בכל פעם, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ רחב שדה כדי להגדיל את ההקלטות העצביות לעשרות Caenorhabditis elegans או אורגניזמים אחרים בקנה מידה תת-מילימטרי בבת אחת. חומרה ותוכנה בקוד פתוח מאפשרות גמישות רבה בתכנות ניסויים אוטומטיים לחלוטין השולטים בעוצמה ובתזמון של סוגי גירויים שונים, כולל גירויים כימיים, אופטיים, מכניים, תרמיים ואלקטרומגנטיים. בפרט, התקני זרימה מיקרופלואידים מספקים בקרה מדויקת, חוזרת וכמותית של גירויים כימו-סנסוריים ברזולוציית זמן של תת-שנייה. צינור ניתוח הנתונים החצי-אוטומטי של NeuroTracker מחלץ תגובות עצביות אינדיבידואליות וכלל אוכלוסייה כדי לחשוף שינויים פונקציונליים ברגישות ובדינמיקה העצבית. מאמר זה מציג דוגמאות למדידת הסתגלות עצבית, עיכוב זמני וגירוי crosstalk. טכניקות אלה מגבירות את הדיוק והחזרתיות של גירוי, מאפשרות לחקור את השתנות האוכלוסיות, והן ניתנות להכללה לאותות פלואורסצנטיים דינמיים אחרים במערכות ביולוגיות קטנות מתאים ואורגנואידים לאורגניזמים שלמים וצמחים.
Introduction
טכניקות הדמיית סידן אפשרו רישום לא פולשני של דינמיקה עצבית in vivo בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומדדי סידן מקודדים גנטית המבוטאים בתאי מטרה 1,2,3. חיישנים אלה משתמשים בדרך כלל בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כגון משפחת הפפטיד GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), כדי להגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות בעת הפעלה עצבית ורמות סידן תוך-תאיות גבוהות. הדמיית סידן הייתה חזקה במיוחד בנמטודה C. elegans לבחינת האופן שבו נוירונים ומעגלים עצביים מתפקדים בבעלי חיים 4,5,6,7,8,9,10, שכן טבעם השקוף פירושו שלא נדרש תהליך כירורגי לגישה אופטית, ומקדמי גנים ספציפיים לתאים מכוונים ביטוי לתאים המעניינים. טכניקות אלה משתמשות לעתים קרובות בהתקנים מיקרופלואידים, המספקים סביבות מבוקרות במדויק לחקר תופעות ביולוגיות, כימיות ופיזיקליות בקנה מידה פיזיקלי קטן11,12. התקנים מיקרופלואידים נמצאים בשפע למדידת פעילות עצבית, עם עיצובים חדשים הנמצאים בפיתוח ללא הרף, והם מיוצרים בקלות במעבדת המחקר. עם זאת, עיצובים רבים לוכדים חיה אחת בכל פעם, ומגבילים את תפוקת הניסוי 7,9,13. תגובות עצביות לעיתים קרובות משתנות באופן משמעותי בין בעלי חיים עקב הבדלים בניסיון קודם, מצבים פנימיים כגון לחץ או רעב, או גורמים סטוכסטיים כגון רמות ביטוי גנים. הבדלים אלה יוצרים צורך בשיטות שיכולות בו זמנית לגרות ולהתבונן בבעלי חיים רבים ולחלץ מידע מפרטים4.
בנוסף, תופעות נוירומודולטוריות מסוימות מתגלות רק בתנאי גירוי ספציפיים, כגון עיכוב זמני14, המתייחס לדיכוי קצר של תגובות כאשר הגירוי מתרחש ברצף מהיר. מערכות אלקטרופיזיולוגיות יכולות להניע פעילות עצבית על פני מרחב גירוי רחב למטרה זו, ומווסת, למשל, את זרם הפולס החשמלי, המתח, התדר, צורת הגל, מחזור העבודה והתזמון של רכבות גירוי תקופתיות. גירוי עקיף על ידי גירויים או מערכות אופטוגנטיות שזוהו באופן טבעי יפיק תועלת מרוחב דומה של מנגנוני בקרה. כיום, גירויים טבעיים רבים מוצגים באופן פשוט “on-off”, כגון הצגה והסרה של ריחות, תוך שימוש במערכות מסחריות שהיו איטיות כדי להוסיף גמישות. עם זאת, מיקרו-בקרים זולים יכולים כעת להפוך את המסירה של מספר סוגים של גירויים לאוטומטית באופן הניתן להתאמה אישית לצרכי החוקרים. בשילוב עם מיקרופלואידיקה, מערכות אלה השיגו את המטרה של תפוקה וגמישות ניסויית מוגברת, המאפשרת לתגובות עצביות למגוון גירויים מדויקים להימדד בו זמנית בבעלי חיים רבים 4,6. גירוי רב-מודאלי יכול לשמש לחקירה נוספת של המעגלים העצביים, כגון על ידי ניטור שינויים ברגישות העצבית בעת גירוי עקבי לפני, במהלך ואחרי הפרעה אורתוגונלית כגון חשיפה לסמים4. היתרונות של מערכות מיקרוסקופיה פתוחות וזולות ברורים לקידום המחקר המדעי, אך בפועל, הצורך במיקור חלקים, בנייה ותיקוף ביצועים יכול לעכב את אימוץ טכניקות אלה.
פרוטוקול זה נועד להקל על חלק מהאתגרים הטכניים הללו. בעוד שהפרוטוקולים הקודמים התמקדו בשימוש בהתקנים מיקרופלואידים ובגירוי בסיסי 9,15,17, אנו מתארים כאן את הבנייה והשימוש במערכת העברת גירויים גמישה, אוטומטית ורב-מודאלית לדימות עצבי ב- C. elegans או באורגניזמים קטנים אחרים המשתמשים בהתקנים מיקרופלואידים שתוארו קודם לכן4. מערכת הקוד הפתוח מתוכנתת באמצעות קבצי טקסט פשוטים כדי להגדיר את הניסויים, ותוכנת ניתוח הנתונים NeuroTracker מחלצת באופן חצי אוטומטי את נתוני הפעילות העצבית מסרטוני המיקרוסקופ. אנו מדגימים את המערכת הזו בעזרת דוגמאות להערכת עיכוב זמני, דיסאינהיביציה וגירוי crosstalk באמצעות תא העצב הכימו-סנסורי AWA, אשר מבצע דה-פולריזציה בתגובה לריחות מזון שונים או בתגובה לאור בעת ביטוי תעלות יונים אופטוגנטיות רגישות לאור 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת מיקרוסקופיה בגישה פתוחה להערכת תופעות פעילות עצבית באמצעות העברה מדויקת זמנית של דפוסי גירוי שונים. הפלטפורמה המיקרופלואידית מספקת גירויים חוזרים תוך שמירה על עשרות בעלי חיים בשדה הראייה של המיקרוסקופ. מעט חבילות תוכנה מסחריות למיקרוסקופיה מאפשרות תכנות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפוקס אייברי על בדיקת פרוטוקולים אלה וסקירת כתב היד ולאריק הול על הסיוע בתכנות. המימון לשיטות המוצגות כאן ניתן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע 1724026 (D.R.A).
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
