Automatisert multimodal stimulering og samtidig nevronopptak fra flere små organismer
Summary
Vi presenterer en metode for fleksibel kjemisk og multimodal stimulering og registrering av samtidig nevral aktivitet fra mange Caenorhabditis elegans ormer. Denne metoden bruker mikrofluidikk, åpen kildekode-maskinvare og programvare, og overvåket automatisert dataanalyse for å muliggjøre måling av nevronfenomener som tilpasning, temporal inhibering og stimulus crosstalk.
Abstract
Fluorescerende genetisk kodede kalsiumindikatorer har bidratt sterkt til vår forståelse av nevral dynamikk fra nivået av individuelle nevroner til hele hjernekretser. Imidlertid kan nevrale responser variere på grunn av tidligere erfaring, interne tilstander eller stokastiske faktorer, og dermed generere behovet for metoder som kan vurdere nevral funksjon på tvers av mange individer samtidig. Mens de fleste opptaksteknikker undersøker et enkelt dyr om gangen, beskriver vi bruken av bredfeltsmikroskopi for å skalere opp nevronopptak til dusinvis av Caenorhabditis elegans eller andre sub-millimeterskala organismer samtidig. Åpen kildekode-maskinvare og programvare gir stor fleksibilitet i programmering av helautomatiserte eksperimenter som styrer intensiteten og timingen av ulike stimulustyper, inkludert kjemiske, optiske, mekaniske, termiske og elektromagnetiske stimuli. Spesielt gir mikrofluidiske strømningsanordninger presis, repeterbar og kvantitativ kontroll av kjemosensoriske stimuli med tidsoppløsning på under sekundet. NeuroTrackers halvautomatiserte dataanalysepipeline trekker deretter ut individuelle og populasjonsomfattende nevrale responser for å avdekke funksjonelle endringer i nevral eksitabilitet og dynamikk. Denne artikkelen presenterer eksempler på måling av nevrontilpasning, temporal inhibering og stimulus crosstalk. Disse teknikkene øker presisjonen og repeterbarheten av stimulering, tillater utforskning av populasjonsvariabilitet, og er generaliserbare til andre dynamiske fluorescerende signaler i små biosystemer fra celler og organoider til hele organismer og planter.
Introduction
Kalsiumavbildningsteknikker har tillatt ikke-invasiv registrering av in vivo nevral dynamikk i sanntid ved bruk av fluorescensmikroskopi og genetisk kodede kalsiumindikatorer uttrykt i målceller 1,2,3. Disse sensorene bruker vanligvis et grønt fluorescerende protein (GFP), for eksempel GFP-calmodulin-M13 peptid (GCaMP) -familien, for å øke fluorescensintensiteten ved nevronaktivering og forhøyede intracellulære kalsiumnivåer. Kalsiumavbildning har vært spesielt kraftig i nematoden C. elegans for å undersøke hvordan nevroner og nevrale kretser fungerer i levende, oppførende dyr 4,5,6,7,8,9,10, da deres gjennomsiktige natur betyr at ingen kirurgisk prosess er nødvendig for optisk tilgang, og cellespesifikke genpromotorer målretter uttrykk til cellene av interesse. Disse teknikkene bruker ofte mikrofluidiske enheter, som gir nøyaktig kontrollerte miljøer for å studere biologiske, kjemiske og fysiske fenomener i liten fysisk skala11,12. Mikrofluidiske enheter florerer for måling av nevral aktivitet, med nye design kontinuerlig under utvikling, og de er lett fabrikkert i forskningslaboratoriet. Imidlertid fanger mange design et enkelt dyr om gangen, og begrenser den eksperimentelle gjennomstrømningen 7,9,13. Nevrale responser varierer ofte betydelig på tvers av dyr på grunn av forskjeller i tidligere erfaring, interne tilstander som stress eller sult, eller stokastiske faktorer som genuttrykksnivåer. Disse forskjellene etablerer et behov for metoder som samtidig kan stimulere og observere mange dyr og trekke ut informasjon fra individer4.
I tillegg blir visse nevromodulerende fenomener tydelige bare under spesifikke stimuleringsforhold, for eksempel tidsmessig inhibering14, som refererer til kortvarig undertrykkelse av responser når stimulering skjer i rask rekkefølge. Elektrofysiologiske systemer kan drive nevral aktivitet over et bredt stimulusrom for dette formålet, modulere for eksempel den elektriske pulsstrømmen, spenningen, frekvensen, bølgeformen, driftssyklusen og tidspunktet for periodiske stimulustog. Indirekte stimulering ved naturlig oppdagede stimuli eller optogenetiske systemer vil dra nytte av en lignende bredde av kontrollmekanismer. For tiden presenteres mange naturlige stimuli på en enkel “on-off” måte, for eksempel luktpresentasjon og fjerning, ved hjelp av kommersielle systemer som har vært sakte for å legge til fleksibilitet. Imidlertid kan billige mikrokontrollere nå automatisere levering av flere typer stimuli på en måte som kan tilpasses forskernes behov. Kombinert med mikrofluidikk har disse systemene oppnådd målet om økt eksperimentell gjennomstrømning og fleksibilitet, slik at nevrale responser på en rekke presise stimuli kan måles samtidig hos mange dyr 4,6. Multimodal stimulering kan brukes til å ytterligere forhøre nevronkretsløpet, for eksempel ved å overvåke endringer i nevral eksitabilitet når konsekvent stimulering før, under og etter en ortogonal forstyrrelse som legemiddeleksponering4. Fordelene med billige, åpne mikroskopisystemer er klare for å fremme vitenskapelig forskning, men i praksis kan behovet for delinnkjøp, konstruksjon og ytelsesvalidering hindre adopsjonen av disse teknikkene.
Denne protokollen tar sikte på å lindre noen av disse tekniske utfordringene. Mens tidligere protokoller har fokusert på bruk av mikrofluidisk enhet og grunnleggende stimulering 9,15,17, beskriver vi her konstruksjonen og bruken av et fleksibelt, automatisert, multimodalt stimulusleveringssystem for nevral avbildning i C. elegans eller andre små organismer som bruker tidligere beskrevne mikrofluidiske enheter4. Open source-systemet er programmert via enkle tekstfiler for å definere eksperimentene, og NeuroTracker-dataanalyseprogrammet trekker automatisk ut nevrale aktivitetsdata fra mikroskopvideoene. Vi demonstrerer dette systemet med eksempler på å vurdere temporal inhibering, disinhibition og stimulus crosstalk ved hjelp av kjemosensorisk nevron AWA, som depolariserer som respons på forskjellige matlukt eller som respons på lys når man uttrykker optogenetiske lysfølsomme ionkanaler 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen beskriver vi et open access-mikroskopisystem for vurdering av nevrale aktivitetsfenomener ved bruk av tidsmessig presis levering av forskjellige stimulusmønstre. Den mikrofluidiske plattformen leverer repeterbare stimuli samtidig som titalls dyr holdes i mikroskopfeltet. Få kommersielle mikroskopiprogramvarepakker tillater enkel programmering av ulike stimulanstidsmønstre, og de som gjør det, krever ofte manuell oppføring av hvert mønster eller proprietære filformater. I motsetning til dette er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Fox Avery for å teste disse protokollene og gjennomgå manuskriptet og Eric Hall for programmeringshjelp. Finansiering for metodene som presenteres her ble delvis gitt av National Science Foundation 1724026 (DRA).
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
