Vi etablerade en musmodell av kronisk leverfibros, som ger en lämplig djurmodell för den virusinducerade leverfibrosmekanistiska studien av gallatresi (BA) och en plattform för framtida BA-behandlingar.
Biliär atresi (BA) är en dödlig sjukdom som involverar obstruktiv gulsot, och det är den vanligaste indikationen för levertransplantation hos barn. På grund av den komplexa etiologin och okänd patogenes finns det fortfarande inga effektiva läkemedelsbehandlingar. För närvarande är den klassiska BA-musmodellen inducerad av rhesus rotavirus (RRV) den vanligaste modellen för att studera patogenesen av BA. Denna modell kännetecknas av tillväxtnedgång, gulsot i huden och slemhinnan, leravföring och mörkgul urin. Histopatologin visar allvarlig leverinflammation och obstruktion av de intrahepatiska och extrahepatiska gallgångarna, som liknar symtomen på human BA. Levern hos möss i slutstadiet i denna modell saknar emellertid fibros och kan inte helt simulera egenskaperna hos leverfibros vid klinisk BA. Den presenterade studien utvecklade en ny BA-musmodell av kronisk leverfibros genom att injicera 5-10 μg anti-Ly6G-antikropp fyra gånger, med luckor på 2 dagar efter varje injektion. Resultaten visade att några av mössen framgångsrikt bildade kronisk BA med typisk fibros efter tidsfördröjningen, vilket innebär att dessa möss representerar en lämplig djurmodell för den virusinducerade leverfibrosmekanistiska studien av BA och en plattform för att utveckla framtida BA-behandlingar.
Biliär atresi (BA) är en allvarlig hepatobiliär sjukdom som ofta förekommer hos spädbarn och småbarn; Specifikt presenterar den som en obliterativ kolangiopati med neonatal gulsot och blek avföring1. Dess kliniska egenskaper är inflammatorisk förstörelse av de intrahepatiska och extrahepatiska gallgångarna och progressiv fibros, som så småningom utvecklas till leversvikt2. Enligt statistiken är förekomsten av BA i asiatiska länder högre än i europeiska och amerikanska länder, och förekomsten av BA i asiatiska länder är 1/8 000. Etiologin för BA inkluderar virusinfektion, onormal gallgångsutveckling, immunförsvar och genetiska variationer3. Kasai-kirurgi är den vanligaste metoden för att förbättra kolestas hos barn med BA, men i slutändan kan detta inte förhindra utvecklingen av fibros4. Den nuvarande behandlingen för BA bygger huvudsakligen på levertransplantation, som begränsas av bristen på leverkällor. En fördjupad studie av patogenesen av BA är det mest direkta sättet att lösa utmaningarna med denna sjukdom. Studier av patogenesen av BA förlitar sig dock huvudsakligen på BA-djurmodeller, och det är viktigt att välja en lämplig djurmodell.
De flesta av de histopatologiska studierna av BA har visat att gallgångshyperplasi (BDP), galltrombos och portalvenfibros är de viktigaste patologiska egenskaperna hos BA, och andra patologiska egenskaper av olika kvaliteter existerar samtidigt, såsom portalinflammatorisk cellinfiltration och hepatocytsvullnad 5,6. För närvarande finns det en mängd olika musmodeller som efterliknar BA, såsom den kroniska 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)-matade musmodellen med segmentell gallgångsobstruktion och perikolangit som involverar de extrahepatiska gallgångarna7 och musmodellen av leverfibros med en intraperitoneal injektion av koltetraklorid8. Gallgångsligeringsmodellen (BDL) kännetecknas av gulsot och snabb portalvenfibros9. Den alfa-naftylisotiocyanat (ANIT)-matade musmodellen uppvisar kolangit begränsad till den intrahepatiska gallgången och hepatocytskada10. En musmodell med långvarig gulsot induceras av fördröjd inokulering av rhesus rotavirus (RRV)11. Även om det finns en mängd olika djurmodeller, särskilt musmodeller, har varje modell sina egna begränsningar. De kan bara simulera en del av sjukdomsegenskaperna hos BA, såsom akut inflammation eller leverfibros i processen med gallvägsatresi, och det finns ingen modell som är mycket förenlig med sjukdomsprocessen och patologiska egenskaper hos BA.
Den klassiska BA-musmodellen induceras av RRV, och denna modell är den mest liknande modellen som BA hos människor. Men medan RRV-inducerade BA-modellmöss visar liknande kliniska symtom och patologiska egenskaper som några av de av extrahepatisk gallatresi, saknar denna modell leverfibros, vilket kraftigt begränsar den djupgående studien av BA-mekanismerna och utvecklingen av nya behandlingar12. Därför utvecklade denna studie en ny BA-musmodell av kronisk leverfibros. Anti-Ly6G-antikropp injicerades intraperitonealt före RRV-inokulering på födelsedagen. Därefter injicerades 5-10 μg anti-Ly6G-antikropp fyra gånger, med mellanrum på 2 dagar mellan varje injektion. BA-symtomen hos möss förbättrades, överlevnadstiden förlängdes och mössen gick in i det kroniska fibrosstadiet. Denna modell simulerar inte bara den akuta fasresponsen hos BA utan efterliknar också processerna i levern och progressiv fibros. Således är det en mer lämplig djurmodell för den mekanistiska studien av BA, och det kan ge en teoretisk grund för att utveckla framtida behandlingar för BA.
Gr-1-molekylen är en myeloid-härledd cellytmarkör som ursprungligen visade sig uttryckas i neutrofiler13. Utarmningen av anti-Ly6G-antikroppar minskar cirkulerande neutrofiler med mer än 90% och förändrar svaret som aktiveras av andra immunceller. Funktionerna hos Gr-1+ cellpopulationer har rapporterats i olika studier med specifika rensningsantikroppar, med varierande effekter identifierade på cytokiner och medierat immunskydd14. Vi har studerat funktionen av Gr-1+ celler i RRV-inokulerade BA-musmodeller. Men eftersom Gr-1-molekylen inte har visat sig uttryckas hos människa har en liknande molekyl, CD177, studerats hos BA-patienter15. Våra data bevisar betydelsen av Gr-1+ cellpopulationer, särskilt i den kroniska fibrotiska fasen av sjukdomen, och ger en lämplig djurmodell för att undersöka potentiella BA-terapier.
I vår studie använde vi anti-Ly6G-antikroppar för att eliminera eller minska Gr-1 + -celler i en musmodell av gallaatresi infekterad med RRV för att förbättra akut BA-syndrom, förlänga överlevnadsgraden och göra det möjligt för BA-möss att gå in i kronisk fas. Att minska antikroppsdosen kan leda till kronisk BA med leverfibros, vilket indikerar att antalet Gr-1 + -celler förändrar resultatet av BA i akuta och kroniska faser. I vår tidigare studie reducerades Gr-1 + -celler efter administrering av anti-Ly6G-antikroppar, och BA-mössens totala överlevnadsstatus förbättrades15. Samtidigt har det rapporterats att Gr-1+ makrofager19, Gr-1+ neutrofiler20, Gr-1+ myeloida celler 21 och Gr-1+ granulocyter kan förbättra fibros i vissa djurmodeller 22. Men i denna studie var Gr-1 + -celler hos möss delvis utarmade med låga doser anti-Ly6G-antikroppar och kollagenavlagringar kvarstod. Som ett resultat kan mer tid behövas för att ta itu med sjukdomen mer noggrant.
Appliceringen av anti-Ly6G-antikroppen minskade inflammation, bevarade delvis gallgångarna och förhindrade akut BA-inducerad död hos möss. Men endast 20% till 30% av mössen gick in i den kroniska fasen av BA; Detta kan vara relaterat till tidpunkten och antalet injektioner av anti-Ly6G-antikroppar. Vi måste ytterligare utforska denna viktiga punkt för att förbättra framgångsgraden. Dessutom anser vi att inte bara Gr-1 + -celler utan även andra immunceller kan spela viktiga roller, såsom NK-celler, T-celler, B-celler och makrofager.
När det gäller protokollet måste vissa detaljer noteras. (i) För att undvika läckage av injicerade läkemedel använder vi en 1 ml insulinspruta med en 0,33 mm diameter nål, eftersom nåldiametern är liten och nålhålet i sprutan är litet, vilket bidrar till att minska risken för läkemedelsläckage. (ii) Före injektionen bör musen fixeras för att förhindra att den rör sig, undvika läkemedelsläckage och därmed ytterligare säkerställa den experimentella effekten. (iii) Under läkemedelsinjektion injicerade vi läkemedlet i ytan eller nedre marginalen av muslevern så långt som möjligt så att läkemedlet kom in i buken och helt kontaktade levern för att träda i kraft. (iv) Injektionen görs vanligtvis från musens övre högra lår, eftersom den nyfödda musens mage och mjälte är i vänster buk och magen är full av mjölk. Om nålen sätts in från vänster sida kan den lätt punktera magen, vilket gör att mjölk strömmar in i buken eller punkterar mjälten och orsakar blödning.
CD177 är en homolog av Ly6G, och uttrycket av CD177 hos BA-patienter har undersökts. CD177 kan användas som en markör för tidig diagnos av BA hos barn, vilket indikerar att CD177+ celler spelar en viktig roll under BA23. Genom att analysera RNA-sekvenseringsdata fann vårt team att CD177-celler var den dominerande populationen av Gr-1 + -celler; Under tiden visade Cd177−/− BALB/ c-möss vaccinerade med RRV en fördröjd debut av BA och minskad morbiditet och dödlighet18. Således har vår kroniska BA-musmodell uppenbara fördelar för att studera patogenesen och sjukdomsprogressionen av BA; det ger också en lämplig djurmodell för att studera potentiella behandlingar för BA.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (81974056) till R.Z. och från National Nature Youth Foundation of China (82101808) och Science and Technology Planning Project of Guangzhou (nr 202102020196) till Z.L.
Balb/c mouse | Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD | 20221000112 | |
rat anti-mouse Ly6G | Bio X Cell | clone 1A8 | West Lebanon, NH |
rat anti-mouse cytokeratin 19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | clone TROMA III | Iowa City, IA |
rat anti-mouse F4/80 | R&D Systems | MAB5580 | Minneapolis, MN |
RRV strain | ATCC | MMU 18006 | Manassas, VA |
Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX7 | |
Leica light microscopy | Leica Microsystems | Leica DMI8+DFC7000T | Wetzlar, Germany |
Hitachi Pre-Analytical Process Automation System | Hitachi | 7600 Clinical Analyzer | Tokyo, Japan |
Isoflurane anesthetic | RWD | R510-22-10 | |
Rhodamine 123 | Sigma-Aldrich | 83702 | |
sirius red dye | Leagene | DC0041 | |
paraffin microtome | Leica Microsystems | RM2235 | |
neutral gum | Solarbio | G8590 |