Vi etablerede en musemodel for kronisk leverfibrose, som giver en passende dyremodel til det virusinducerede leverfibrose mekanistiske studie af galdeatresi (BA) og en platform for fremtidige BA-behandlinger.
Biliær atresi (BA) er en dødelig sygdom, der involverer obstruktiv gulsot, og det er den mest almindelige indikation for levertransplantation hos børn. På grund af den komplekse ætiologi og ukendte patogenese er der stadig ingen effektive lægemiddelbehandlinger. På nuværende tidspunkt er den klassiske BA-musemodel induceret af rhesusrotavirus (RRV) den mest almindeligt anvendte model til undersøgelse af patogenesen af BA. Denne model er kendetegnet ved vækstretardering, gulsot i hud og slimhinde, lerafføring og mørk gul urin. Histopatologien viser alvorlig leverbetændelse og obstruktion af de intrahepatiske og ekstrahepatiske galdekanaler, som ligner symptomerne på human BA. Imidlertid mangler leveren hos mus i slutstadiet i denne model fibrose og kan ikke fuldt ud simulere egenskaberne ved leverfibrose i klinisk BA. Den præsenterede undersøgelse udviklede en ny BA-musemodel af kronisk leverfibrose ved at injicere 5-10 μg anti-Ly6G-antistof fire gange med mellemrum på 2 dage efter hver injektion. Resultaterne viste, at nogle af musene med succes dannede kronisk BA med typisk fibrose efter tidsforløbet, hvilket betyder, at disse mus repræsenterer en passende dyremodel til den virusinducerede leverfibrose mekanistiske undersøgelse af BA og en platform til udvikling af fremtidige BA-behandlinger.
Biliær atresi (BA) er en alvorlig hepatobiliær sygdom, der ofte forekommer hos spædbørn og småbørn; Specifikt præsenterer den som en udslettende cholangiopati med neonatal gulsot og bleg afføring1. Dens kliniske egenskaber er inflammatorisk ødelæggelse af de intrahepatiske og ekstrahepatiske galdekanaler og progressiv fibrose, som til sidst udvikler sig til leversvigt2. Ifølge statistikker er forekomsten af BA i asiatiske lande højere end i europæiske og amerikanske lande, og forekomsten af BA i asiatiske lande er 1/8.000. Ætiologien af BA omfatter virusinfektion, unormal galdegang udvikling, immunsygdomme, og genetiske variationer3. Kasai kirurgi er den mest almindeligt anvendte metode til at forbedre kolestase hos børn med BA, men i sidste ende kan dette ikke forhindre progression af fibrose4. Den nuværende behandling for BA er hovedsageligt afhængig af levertransplantation, som er begrænset af manglen på leverkilder. En grundig undersøgelse af patogenesen af BA er det mest direkte middel til at løse udfordringerne ved denne sygdom. Undersøgelser af patogenesen af BA er imidlertid hovedsageligt afhængige af BA-dyremodeller, og det er afgørende at vælge en passende dyremodel.
De fleste histopatologiske undersøgelser af BA har vist, at galdegangshyperplasi (BDP), galdetrombose og portalvenefibrose er de vigtigste patologiske træk ved BA, og andre patologiske træk af forskellige kvaliteter findes på samme tid, såsom portalinflammatorisk celleinfiltration og hepatocythævelse 5,6. På nuværende tidspunkt er der en række musemodeller, der efterligner BA, såsom den kroniske 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC) -fodrede musemodel med segmental galdegangsobstruktion og pericholangitis, der involverer de ekstrahepatiske galdekanaler7 og musemodellen af leverfibrose med en intraperitoneal injektion af carbontetrachlorid8. Galdekanalligeringsmodellen (BDL) er kendetegnet ved gulsot og hurtig portalvenefibrose9. Den alfa-naphthylisothiocyanat (ANIT) -fodrede musemodel præsenterer med cholangitis begrænset til den intrahepatiske galdegang og hepatocytskade10. En musemodel med langvarig gulsot induceres af forsinket rhesusrotavirus (RRV) podning11. Selvom der er en række dyremodeller, især musemodeller, har hver model sine egne begrænsninger. De kan kun simulere en del af sygdomsegenskaberne ved BA, såsom akut betændelse eller leverfibrose i processen med galde atresi, og der er ingen model, der er meget i overensstemmelse med sygdomsprocessen og patologiske træk ved BA.
Den klassiske BA-musemodel induceres af RRV, og denne model er den mest lignende model til BA hos mennesker. Mens RRV-inducerede BA-modelmus imidlertid viser lignende kliniske symptomer og patologiske egenskaber som nogle af dem ved ekstrahepatisk galdeatresi, mangler denne model leverfibrose, hvilket i høj grad begrænser den dybtgående undersøgelse af BA-mekanismerne og udviklingen af nye behandlinger12. Derfor udviklede denne undersøgelse en ny BA-musemodel af kronisk leverfibrose. Anti-Ly6G-antistof blev intraperitonealt injiceret før RRV-podning på fødselsdagen. Derefter blev 5-10 μg anti-Ly6G-antistof injiceret fire gange med mellemrum på 2 dage mellem hver injektion. BA-symptomerne hos mus blev forbedret, overlevelsestiden blev forlænget, og musene kom ind i kronisk fibrose-stadiet. Denne model simulerer ikke kun BA’s akutte faserespons, men efterligner også leverprocesserne og progressiv fibrose. Det er således en mere velegnet dyremodel til mekanistisk undersøgelse af BA, og det kan give et teoretisk grundlag for at udvikle fremtidige behandlinger for BA.
Gr-1-molekylet er en myeloidafledt celleoverflademarkør, der oprindeligt viste sig at være udtrykt i neutrofiler13. Udtømningen af anti-Ly6G-antistoffer reducerer cirkulerende neutrofiler med mere end 90% og ændrer responsen aktiveret af andre immunceller. Funktionerne af Gr-1+ cellepopulationer er blevet rapporteret i forskellige undersøgelser ved anvendelse af specifikke skylleantistoffer med varierende virkninger identificeret på cytokiner og medieret immunbeskyttelse14. Vi har undersøgt funktionen af Gr-1+ celler i RRV-inokulerede BA-musemodeller. Da Gr-1-molekylet imidlertid ikke har vist sig at blive udtrykt hos mennesker, er et lignende molekyle, CD177, blevet undersøgt hos BA-patienter15. Vores data beviser betydningen af Gr-1+ cellepopulationer, især i sygdommens kroniske fibrotiske fase, og giver en passende dyremodel til at undersøge potentielle BA-behandlinger.
I vores undersøgelse brugte vi anti-Ly6G-antistof til at eliminere eller mindske Gr-1+ celler i en musemodel af galdeatresi inficeret med RRV for at forbedre akut BA-syndrom, forlænge overlevelsesraten og gøre det muligt for BA-mus at komme ind i den kroniske fase. Reduktion af antistofdosis kan føre til kronisk BA med leverfibrose, hvilket indikerer, at antallet af Gr-1+ celler ændrer resultatet af BA i de akutte og kroniske faser. I vores tidligere undersøgelse blev Gr-1+ celler reduceret efter administration af anti-Ly6G antistof, og den samlede overlevelsesstatus for BA-musene blev forbedret15. Samtidig er det blevet rapporteret, at Gr-1 + makrofager19, Gr-1 + neutrofiler 20, Gr-1 + myeloide celler21 og Gr-1 + granulocytter kan forbedre fibrose i nogle dyremodeller 22. I denne undersøgelse blev Gr-1 + celler hos mus imidlertid delvist udtømt med lave doser anti-Ly6G-antistof, og kollagenaflejringer forblev. Som følge heraf kan der være behov for mere tid til at behandle sygdommen mere grundigt.
Anvendelsen af anti-Ly6G-antistoffet nedsatte inflammation, bevarede delvist galdegangene og forhindrede akut BA-induceret død hos mus. Imidlertid kom kun 20% til 30% af musene ind i den kroniske fase af BA; Dette kan være relateret til tidspunktet og antallet af injektioner af anti-Ly6G-antistof. Vi er nødt til at undersøge dette nøglepunkt yderligere for at forbedre succesraten. Derudover mener vi, at ikke kun Gr-1+ celler, men også andre immunceller kan spille vigtige roller, såsom NK-celler, T-celler, B-celler og makrofager.
Hvad angår protokollen, skal nogle detaljer noteres. (i) For at undgå lækage af injicerede lægemidler bruger vi en 1 ml insulinsprøjte med en nål med en diameter på 0,33 mm, fordi nålediameteren er lille, og nålehullet i sprøjten er lille, hvilket bidrager til at reducere muligheden for lægemiddellækage. (ii) Før injektionen skal musen fastgøres for at forhindre den i at bevæge sig, undgå lægemiddellækage og dermed yderligere sikre den eksperimentelle effekt. (iii) Under lægemiddelinjektion injicerede vi lægemidlet så vidt muligt i overfladen eller den nedre margen af museleveren, så lægemidlet kom ind i maven og kontaktede leveren fuldt ud for at træde i kraft. (iv) Injektionen foretages normalt fra musens øverste højre lår, fordi den nyfødte mus’ mave og milt er i venstre del af maven, og maven er fuld af mælk. Hvis nålen indsættes fra venstre side, kan den let punktere maven, hvilket får mælk til at strømme ind i maven eller punktere milten og forårsage blødning.
CD177 er en homolog af Ly6G, og ekspressionen af CD177 hos BA-patienter er blevet undersøgt. CD177 kan bruges som markør for tidlig diagnose af BA hos børn, hvilket indikerer, at CD177+ celler spiller en væsentlig rolle i løbet af BA23. Ved at analysere RNA-sekventeringsdataene fandt vores team, at CD177-celler var den dominerende population af Gr-1 + celler; i mellemtiden viste Cd177−/− BALB/c-mus vaccineret med RRV en forsinket debut af BA og reduceret sygelighed og dødelighed18. Således har vores kroniske BA-musemodel åbenlyse fordele ved at studere patogenesen og sygdomsprogressionen af BA; det giver også en passende dyremodel til at studere potentielle behandlinger for BA.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81974056) til R.Z. og fra National Nature Youth Foundation of China (82101808) og Science and Technology Planning Project of Guangzhou (nr. 202102020196) til Z.L.
Balb/c mouse | Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD | 20221000112 | |
rat anti-mouse Ly6G | Bio X Cell | clone 1A8 | West Lebanon, NH |
rat anti-mouse cytokeratin 19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | clone TROMA III | Iowa City, IA |
rat anti-mouse F4/80 | R&D Systems | MAB5580 | Minneapolis, MN |
RRV strain | ATCC | MMU 18006 | Manassas, VA |
Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX7 | |
Leica light microscopy | Leica Microsystems | Leica DMI8+DFC7000T | Wetzlar, Germany |
Hitachi Pre-Analytical Process Automation System | Hitachi | 7600 Clinical Analyzer | Tokyo, Japan |
Isoflurane anesthetic | RWD | R510-22-10 | |
Rhodamine 123 | Sigma-Aldrich | 83702 | |
sirius red dye | Leagene | DC0041 | |
paraffin microtome | Leica Microsystems | RM2235 | |
neutral gum | Solarbio | G8590 |