क्रायो-एसटीईएम टोमोग्राफी एम्बेडिंग, सेक्शनिंग या अन्य आक्रामक तैयारी के बिना बरकरार कोशिकाओं के ऑर्गेनेल की कल्पना करने का एक साधन प्रदान करता है। प्राप्त 3 डी रिज़ॉल्यूशन वर्तमान में कुछ नैनोमीटर की सीमा में है, जिसमें कई माइक्रोमीटर का क्षेत्र और 1 μm के क्रम में एक सुलभ मोटाई है।
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) उनके मूल जलीय माध्यम में एम्बेडेड जैविक या कार्बनिक नमूनों की इमेजिंग पर निर्भर करता है; क्रिस्टलीकरण के बिना पानी को एक गिलास (यानी, विट्रीफाइड) में ठोस किया जाता है। क्रायो-ईएम विधि का व्यापक रूप से जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचना को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, हाल ही में निकट-परमाणु संकल्प पर। दृष्टिकोण को टोमोग्राफी का उपयोग करके ऑर्गेनेल और कोशिकाओं के अध्ययन के लिए विस्तारित किया गया है, लेकिन वाइड-फील्ड ट्रांसमिशन ईएम इमेजिंग का पारंपरिक मोड नमूना मोटाई में एक गंभीर सीमा से ग्रस्त है। इससे एक केंद्रित आयन बीम का उपयोग करके पतली लैमेला मिलिंग का अभ्यास किया गया है; पुनर्निर्माण से औसत सबटोमोग्राम द्वारा उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जाता है, लेकिन शेष परत के बाहर त्रि-आयामी संबंध खो जाते हैं। स्कैनिंग ईएम या कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के समान स्कैन की गई जांच इमेजिंग द्वारा मोटाई सीमा को दरकिनार किया जा सकता है। जबकि सामग्री विज्ञान में स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसटीईएम) एकल छवियों में परमाणु संकल्प प्रदान करता है, इलेक्ट्रॉन विकिरण के लिए क्रायोजेनिक जैविक नमूनों की संवेदनशीलता के लिए विशेष विचार की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल एसटीईएम का उपयोग करके क्रायो-टोमोग्राफी के लिए एक सेटअप प्रस्तुत करता है। माइक्रोस्कोप के मूल सामयिक विन्यास को दो और तीन-कंडेनसर सिस्टम दोनों के लिए वर्णित किया गया है, जबकि स्वचालन गैर-वाणिज्यिक सीरियलईएम सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान किया जाता है। बैच अधिग्रहण और पहले से अधिग्रहित प्रतिदीप्ति मानचित्रों के सापेक्ष संरेखण के लिए वृद्धि भी वर्णित है। एक उदाहरण के रूप में, हम एक माइटोकॉन्ड्रियन के पुनर्निर्माण को दिखाते हैं, आंतरिक और बाहरी झिल्ली और कैल्शियम फॉस्फेट कणिकाओं, साथ ही आसपास के सूक्ष्मनलिकाएं, एक्टिन फिलामेंट्स और राइबोसोम को इंगित करते हैं। क्रायो-एसटीईएम टोमोग्राफी साइटोप्लाज्म में ऑर्गेनेल के थिएटर को प्रकट करने में उत्कृष्टता प्राप्त करती है और, कुछ मामलों में, यहां तक कि संस्कृति में अनुयायी कोशिकाओं की परमाणु परिधि भी।
ऑर्गेनेल का त्रि-आयामी (3 डी) विज़ुअलाइज़ेशन आधुनिक सेल जीव विज्ञान में एक सर्वोपरि कार्य है। इसमें शामिल तराजू को देखते हुए, स्रावी पुटिकाओं के लिए दसियों नैनोमीटर से लेकर सेल नाभिक के लिए कई माइक्रोन तक, सभी अनुप्रयोगों को फिट करने के लिए एक माइक्रोस्कोपी तकनीक खोजना चुनौतीपूर्ण है। जबकि आधुनिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रिज़ॉल्यूशन के मामले में सीमा का अधिकांश विस्तार कर सकती है, केवल लेबल किए गए अणु दिखाई देते हैं। सेलुलर थिएटर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का क्षेत्र बना हुआ है। रासायनिक निर्धारण, प्लास्टिक एम्बेडिंग, और भारी धातुओं के साथ धुंधला करने के पारंपरिक तरीके दृढ़ता से आक्रामक हैं, इसलिए परिणाम नमूना तैयारी के विवरण पर निर्भर हो सकते हैं। दूसरी ओर, क्रायो-ईएम, जलीय माध्यम को विट्रीफाई करने की आवश्यकता से बाधित है; बर्फ के क्रिस्टल जो इलेक्ट्रॉन रोशनी को अलग करते हैं, जिससे कार्बनिक पदार्थ की तुलना में उच्च कंट्रास्ट की विपरीत कलाकृतियां होती हैं।
पिछले दशक में सेलुलर अध्ययन के लिए विकसित या अनुकूलित ईएम इमेजिंग तकनीकों का प्रसार देखा गयाहै। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (यानी, एफआईबी-एसईएम) का उपयोग करके पुनरावृत्ति केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) मिलिंग और सीरियल सरफेस इमेजिंग के साथ संयुक्त उच्च दबाव ठंड वर्तमान में बड़े नमूनों के लिए पसंद की विधिहै। क्रायोजेनिक सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी (क्रायो-एसएक्सटी) आकार में कई माइक्रोन के नमूनों के लिए उपयुक्त है, जो पानी में नरम एक्स-रे की विशिष्ट अवशोषण लंबाई 3,4,5 द्वारा सीमित है। इस पैमाने में कई बरकरार सेल प्रकार शामिल हैं, और एक्स-रे अवशोषण कंट्रास्ट की मात्रात्मक प्रकृति एकाग्रता माप6 या स्पेक्ट्रोस्कोपी7 का एक पहलू जोड़ती है। जब सबटोमोग्राम औसत के साथ जोड़ा जाता है, तो क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी), चरण कंट्रास्ट ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के आधार पर, मैक्रोमोलेक्यूल्स या कॉम्प्लेक्स 8,9,10 के लिए उच्चतम रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। हालांकि, यह दुर्लभ है कि बरकरार ऑर्गेनेल इतने नियमित हैं कि उन्हें पूरे औसत किया जा सकता है। इसके अलावा, वाइड-फील्ड टीईएम का पारंपरिक मोड नमूना में इनलेस्टिक स्कैटरिंग (ऊर्जा हानि को शामिल करते हुए) और चुंबकीय उद्देश्य लेंस11,12 में क्रोमैटिक विपथन के संयोजन से नमूना मोटाई के लिए कुछ सौ नैनोमीटर तक सीमित है। बड़ी ऊर्जा प्रसार परिणामी आउट-ऑफ-फोकस धुंध को हटाने के लिए एक ऊर्जा फिल्टर के उपयोग को निर्देशित करता है, लेकिन संवेदनशील नमूना अभी भी विकिरण क्षति का सामना करता है जबकि छवि संकेत बढ़ती मोटाई के साथ तेजी से कमजोर हो जाता है।
वैकल्पिक इमेजिंग मोड, स्कैनिंग ट्रांसमिशन ईएम (एसटीईएम), ऊर्जा फ़िल्टरिंग की आवश्यकता को दरकिनार करता है और छवि निर्माण के लिए असंगत रूप से बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों को बरकरार रखता है, हालांकि वर्तमान में टीईएम टोमोग्राफी (चित्रा 1) की तुलना में कम रिज़ॉल्यूशन पर। वास्तव में, कोई वास्तविक छवि नहीं बनती है। इसके बजाय, स्कैनिंग ईएम के रूप में, माप बिंदु-दर-बिंदु किए जाते हैं, और छवि को कंप्यूटर द्वारा इकट्ठा किया जाता है। आवर्धन केवल लेंस धाराओं को बदलने के बिना स्कैन चरणों के आकार से निर्धारित होता है। जब ठीक से कॉन्फ़िगर किया जाता है, तो क्रायो-एसटीईएम टोमोग्राफी (सीएसटीईटी) के लिए नमूना मोटाई की उपयोगी सीमा 1.5 या 2 μm तक पहुंच सकती है, हालांकि आराम क्षेत्र, जहां उपयोगी सिग्नल तीव्रता रोशनी का एक महत्वपूर्ण अंश बनी हुई है, लगभग 600-900 एनएम11,13 है। यह साइटोप्लाज्म के एक बड़े अंश को देखने के लिए पर्याप्त है, और कभी-कभी सेल नाभिक का एक किनारा होता है। व्यवहार में, हम पाते हैं कि क्रायोजेनिक द्रव में गिरने की मानक विधि द्वारा विट्रीफिकेशन एसटीईएम इमेजिंग की तुलना में मोटाई पर अधिक गंभीर बाधा डालता है। इस वीडियो लेख का लक्ष्य अनुसंधान प्रयोगशालाओं और माइक्रोस्कोपी सुविधाओं में सेल और ऑर्गेनेल इमेजिंग के लिए टूल चेस्ट में सीएसटीईटी को शामिल करने की सुविधा प्रदान करना है।
पहली चुनौती यह है कि सीएसटीईटी में माइक्रोस्कोप संचालन अभी तक जीवन विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए मानकीकृत नहीं हैं जिस तरह से वे क्रायो-टीईएम टोमोग्राफी के लिए रहे हैं। एसटीईएम हार्डवेयर को क्रायो-ईएम बाजार में शायद ही कभी (यदि कभी) लक्षित किया गया है। हालांकि, यह माइक्रोस्कोप की नवीनतम पीढ़ी के साथ बदल रहा है, और कई मौजूदा उपकरणों को रेट्रोफिट किया जा सकता है। एक तकनीक के रूप में एसटीईएम ने आगे बढ़ लिया है और बड़े पैमाने पर सामग्री विज्ञान में कब्जा कर लिया है, जहां क्रायोजेनिक और कम खुराकके तरीकों में भी रुचि बढ़ रही है। सामग्री विज्ञान साहित्य बीएफ-एसटीईएम, एडीएफ-एसटीईएम, एचएडीएफ-एसटीईएम, 4 डी-एसटीईएम, डीपीसी-एसटीईएम, आदि के संक्षिप्त नामों से भरा हुआ है, जो भ्रम को बढ़ाते हैं। हम यहां एक अनुशंसित प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं, जो वीज़मैन इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस में हमारे सामूहिक अनुभव में, उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) एसटीईएम इमेजिंग16 के आधार पर उपयोगी परिणामों के लिए सबसे सामान्य प्रोटोकॉल प्रदान करता है। किसी भी तरह से यह संभावनाओं की सीमा को समाप्त या यहां तक कि तलाशता नहीं है, लेकिन यह आगे की वृद्धि के लिए एक आधार के रूप में काम करेगा। जबकि हम क्रायो-एसटीईएम पर जोर देते हैं, अधिकांश प्रोटोकॉल प्लास्टिक-एम्बेडेड वर्गों के कमरे के तापमान एसटीईएम टोमोग्राफी के लिए समान रूप से प्रासंगिक है।
एसटीईएम का सार एक केंद्रित इलेक्ट्रॉन जांच (चित्रा 1), रोशनी शंकु के साथ नमूने को स्कैन करना है, और ट्रांसमिशन में विवर्तन (प्रकीर्णन) विमान से संकेतों को रिकॉर्ड करना है, पिक्सेल द्वारा पिक्सेल, 2 डी छवियों17,18 का उत्पादन करने के लिए। अधिकांश सेलुलर सामग्रियों सहित अनाकार नमूने, संचरण में एक फैलाव प्रकीर्णन पैटर्न का उत्पादन करेंगे। सबसे सरल व्यावहारिक एसटीईएम कॉन्फ़िगरेशन केंद्रीय डिस्क को रिकॉर्ड करने के लिए एक परिपत्र डिटेक्टर रखना है (यानी, जांच रोशनी जो नमूने के बिना प्रेषित की जाएगी)। नमूना इस रोशनी शंकु से इलेक्ट्रॉनों को इस हद तक दूर बिखेरता है कि सिग्नल कम हो जाता है। यह एक बीएफ छवि पैदा करता है-नमूना एक उज्ज्वल पृष्ठभूमि पर अंधेरा दिखाई देता है। एक वलयाकार डिटेक्टर का उपयोग (या इसके बजाय) रोशनी शंकु के बाहर नमूने से प्रकीर्णन का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। नमूना हटाए जाने के साथ, कोई संकेत नहीं है। जब एक नमूना जगह में होता है, तो ऑब्जेक्ट अंधेरे क्षेत्र (डीएफ) छवि में एक अंधेरे पृष्ठभूमि पर उज्ज्वल दिखाई देते हैं। एसटीईएम (बीएफ, वलयाकार डार्क फील्ड [एडीएफ], उच्च-कोण वलयाकार डार्क फील्ड [एचएडीएफ], आदि) के लिए नामकरण मुख्य रूप से डिटेक्टरों के लिए संग्रह कोणों की श्रेणियों को संदर्भित करता है।
रोशनी का अभिसरण कोण सेलुलर टोमोग्राफी के लिए एसटीईएम के एक आवश्यक अनुकूलन का प्रतिनिधित्व करता है। जब शीर्ष प्राथमिकता उच्च रिज़ॉल्यूशन होती है, तो अभिसरण कोण जितना संभव हो उतना बड़ा होना चाहिए। (यह कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के समान है; रिज़ॉल्यूशन जांच व्यास द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो संख्यात्मक एपर्चर द्वारा विभाजित तरंग दैर्ध्य के रूप में स्केल करता है। ध्यान दें कि हम ईएम के लिए अर्ध-कोण या अर्ध-अभिसरण कोण का उल्लेख करते हैं। जब प्राथमिकता क्षेत्र की गहराई होती है, तो दूसरी ओर, रिज़ॉल्यूशन में समझौता एक बड़ा लाभ देता है, क्योंकि केंद्रित बीम अर्ध-कोण वर्ग द्वारा विभाजित तरंग दैर्ध्य के दोगुने के बराबर दूरी के लिए लगभग समानांतर रहता है। आदर्श रूप से, पूरे सेल वॉल्यूम फोकस19 में रहता है। उदाहरण के लिए, 300 केवी पर, इलेक्ट्रॉन डीब्रोगली तरंग दैर्ध्य 0.002 एनएम है, इसलिए 1 मराड के अभिसरण से 2 एनएम का रिज़ॉल्यूशन और 4 माइक्रोन के क्षेत्र की गहराई उत्पन्न होती है। इन शर्तों के तहत, टोमोग्राफी को डेटा संग्रह प्रक्रिया के दौरान ध्यान केंद्रित किए बिना भी किया जा सकता है, लेकिन अधिग्रहण की शुरुआत में केवल एक बार। एक पारंपरिक टोमोग्राफी-सक्षम एसटीईएम 7 या 8 मैराड के अर्ध-अभिसरण कोण तक पहुंच सकता है; इसलिए, सिद्धांत रूप में, हम 0.25 एनएम के क्रम में एक संकल्प तक पहुंच सकते हैं, लेकिन फिर केवल 62 एनएम की फोकल गहराई के साथ। यह सेलुलर इमेजिंग के लिए स्पष्ट रूप से बहुत पतला है। तीन कंडेनसर लेंस के साथ अधिक उन्नत माइक्रोस्कोप काफी सीमा पर अर्ध-अभिसरण कोण के निरंतर समायोजन की पेशकश करते हैं। अधिक पारंपरिक दो-कंडेनसर कॉन्फ़िगरेशन के साथ, अभिसरण कंडेनसर (सी 2) एपर्चर द्वारा असतत रूप से तय किया जाता है।
मजबूत, प्लास्टिक-एम्बेडेड नमूनों के लिए, कोई प्रत्येक झुकाव पर एक फोकल श्रृंखला रिकॉर्ड कर सकता है और उन्हें उच्च रिज़ॉल्यूशन20 के लिए जोड़ सकता है, लेकिन क्रायोजेनिक नमूनों के लिए, विकिरण बजट बहुत गंभीर रूप से बाधित है। अंत में, मोटे नमूनों के लिए, बीएफ या डीएफ इमेजिंग के फायदों को तौलने में, किसी को नमूने में कई लोचदार प्रकीर्णन के प्रभावों पर विचार करना चाहिए। बीएफ सिग्नल कई प्रकीर्णन द्वारा कम दूषित होता है और मोटे नमूनों16,21 के लिए एक उच्च रिज़ॉल्यूशन दिखाता है।
अंगूठे का एक उपयोगी नियम अभिसरण की तुलना में कई गुना बड़े संग्रह कोण सेट करना है। नमूना जितना मोटा होगा, संग्रह डिस्क उतनी ही बड़ी होनी चाहिए। बहुत छोटी डिस्क कम सिग्नल तीव्रता प्रदान करेगी; बहुत बड़ी डिस्क के परिणामस्वरूप खराब छवि कंट्रास्ट होगा, क्योंकि केवल उच्चतम-कोण प्रकीर्णन योगदान देगा। संग्रह कोण ों को किसी दिए गए नमूने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। (विवर्तन) कैमरे की लंबाई के एक फ़ंक्शन के रूप में डिटेक्टर कोणों को स्वतंत्र रूप से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। उन्हें माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा आसानी से प्रदर्शित किया जा सकता है। व्यवहार में, संग्रह से रोशनी अर्ध-कोणों के अनुपात में दो से पांच का कारक, क्रमशः α से , सेलुलर नमूनों के सीएसटीईटी के लिए एक अनुशंसित प्रारंभिक बिंदु है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल माइक्रोस्कोप नियंत्रण22,23 के लिए लोकप्रिय सीरियलईएम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एसटीईएम टोमोग्राफी ऑपरेशन का वर्णन करता है। सीरियलईएम एक विशिष्ट निर्माता से जुड़ा नहीं है, और इसका व्यापक रूप से टीईएम टोमोग्राफी में उपयोग किया जाता है। टोमोग्राफी के लिए स्थापित करने में अधिकांश ऑपरेशन सीधे टीईएम से किए जा सकते हैं। सीरियलईएम रणनीति स्कैनिंग सिस्टम को कैमरे के रूप में मॉडल करना है। यह टीईएम से एसटीईएम तक सरल क्रॉसओवर को सक्षम बनाता है। हालांकि, किसी को यह ध्यान रखना चाहिए कि आवर्धन और बिनिंग जैसे पैरामीटर पूरी तरह से कृत्रिम हैं। महत्वपूर्ण पैरामीटर माइक्रोन में दृश्य का क्षेत्र, दृश्य के क्षेत्र में पिक्सेल की संख्या और एक्सपोज़र समय हैं। पिक्सेल स्पेसिंग, या नमूनाकरण, पिक्सेल की संख्या से विभाजित रैखिक क्षेत्र है, जबकि रहने का समय एक्सपोज़र समय से विभाजित पिक्सेल की संख्या है।
एसटीईएम और सीएसटीईटी के लिए न्यूनतम कॉन्फ़िगरेशन में माइक्रोस्कोप पर तीन विशेषताएं शामिल हैं: एक स्कैन जनरेटर, एक एसटीईएम डिटेक्टर और टोमोग्राफी कंट्रोल सॉफ्टवेयर। प्रोटोकॉल एफईआई / थर्मो फिशर साइंटिफिक (टीएफएस) के नामकरण को संदर्भित करता है, लेकिन अवधारणाएं सामान्य हैं। टीएफएस के मालिकाना सॉफ्टवेयर को टीईएम24 के लिए जोव में वर्णित किया गया है, और एसटीईएम ऑपरेशन बहुत समान है।
हम मानते हैं कि माइक्रोस्कोप को सेवा टीम या अनुभवी कर्मचारियों द्वारा अग्रिम में संरेखित किया गया है और फ़ाइल लोड करके कॉलम संरेखण को बुलाया जा सकता है। मामूली समायोजन को प्रत्यक्ष संरेखण कहा जाता है और इसे तथाकथित एफईजी रजिस्टरों (टीएफएस माइक्रोस्कोप) में संग्रहीत किया जा सकता है। प्रत्यक्ष संरेखण में रोटेशन केंद्र, धुरी बिंदु, विवर्तन संरेखण और कंडेनसर एस्टिगमैटिज्म के लिए मुआवजा शामिल है। समायोजन को पुनरावृत्ति रूप से किया जाना चाहिए। ध्यान दें कि टीएफएस माइक्रोस्कोप अलग-अलग नैनोप्रोब (एनपी) और माइक्रोप्रोब (μP) मोड को लागू करते हैं; किसी दिए गए कंडेनसर एपर्चर के लिए, ये क्रमशः टीईएम में समानांतर रोशनी और एसटीईएम में अधिक या कम अभिसरण (कसकर केंद्रित) इलेक्ट्रॉन बीम के साथ अपेक्षाकृत संकीर्ण या विस्तृत क्षेत्र प्रदान करते हैं। अन्य निर्माता अभिसरण कोणों की सीमा को कवर करने के लिए विभिन्न योजनाओं का उपयोग करते हैं।
शुरू करने से पहले, अध्ययन के तहत नमूने के आधार पर दृश्य, एल, और नमूनाकरण (पिक्सेल चौड़ाई), एल का क्षेत्र चुना जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, l = 1 nm/pixel के लिए, एक 4,000 x 4,000 पिक्सेल छवि जो दृश्य 4 μm2 के क्षेत्र को कवर करेगी, चुनी जानी चाहिए। रिज़ॉल्यूशन, अधिक से अधिक, स्थानिक नमूने से दोगुना होगा, इसलिए 2 एनएम, और जांच व्यास, डी, इससे मेल खाना चाहिए। जांच कोण का अंशांकन इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है, इसलिए हम मानते हैं कि एक तालिका या स्क्रीन रीडिंग उपलब्ध है। प्रोब व्यास लगभग इलेक्ट्रॉन तरंग दैर्ध्य है जो अर्ध-अभिसरण कोण (रेडियन में) से विभाजित है: d = o/o। तरंग दैर्ध्य, 300 केवी के लिए 0.002 एनएम और 200 केवी इलेक्ट्रॉनों के लिए 0.0025 एनएम है, इसलिए 1 मराड का व्यास क्रमशः 2 या 2.5 एनएम का स्पॉट व्यास प्रदान करेगा।
प्रोटोकॉल बढ़ती जटिलता की प्रगति में प्रस्तुत किया गया है। पहला कार्य एक एसटीईएम छवि का उत्पादन करना है, जो माइक्रोस्कोप निर्माता के सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, और फिर एक झुकाव श्रृंखला, जिसके लिए हम सीरियलईएम का उपयोग करते हैं। कई पाठक निस्संदेह सीरियलईएम से परिचित होंगे, इसलिए अधिक जटिल कार्य स्वाभाविक रूप से आएंगे। प्रक्रियाओं का सख्ती से पालन करने की कोई आवश्यकता नहीं है। स्वचालन से संबंधित विकास सीधे एसटीईएम के साथ-साथ टीईएम के लिए भी लागू किया जा सकता है। अनुभवी उपयोगकर्ता संभवतः प्रोटोकॉल को उलट देंगे, जो फ्लोरेसेंस मैप्स के सापेक्ष पंजीकरण से शुरू होगा और बैच टोमोग्राफी स्थापित करना जारी रखेगा। अधिक विवरण सीरियलईएम के लिए व्यापक प्रलेखन और ट्यूटोरियल पुस्तकालयों में पाया जा सकता है, जिसमें स्वचालन25 में नवीनतम विकास पर हाल ही में जोवे लेख शामिल है।
प्रोटोकॉल को जीवन विज्ञान माइक्रोस्कोपी की सहायता करनी चाहिए जो सेल के क्षेत्रों में इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल के 3 डी दृश्य प्राप्त करने में रुचि रखते हैं जो पारंपरिक टीईएम टोमोग्राफी के लिए सुलभ नहीं हैं। इसी प्रोटोकॉल का उपयोग प्लास्टिक वर्गों के एसटीईएम टोमोग्राफी के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें एक्सपोजर पर आराम की बाधाएं होती हैं। प्रोटोकॉल को कठोर नियमों के एक सेट के बजाय एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में माना जाना चाहिए। दरअसल, एसटीईएम की शक्ति इसका लचीलापन है; इसे संचालित करने का कोई एक सही तरीका नहीं है।
हम इस बात पर जोर देते हैं कि एसटीईएम, केवल स्कैन की गई जांच को संदर्भित करता है और छवि गठन को परिभाषित नहीं करता है। कंट्रास्ट मुख्य रूप से डिटेक्टरों के विन्यास पर निर्भर करता है। अधिक सरल तरीके अक्षीय समरूपता वाले डिटेक्टरों को नियोजित करते हैं, या तो ऑप्टिक अक्ष पर केंद्रित डिस्क या इसके आसपास एक वार्षिकी। सामान्य तौर पर, जब रोशनी सीधे डिटेक्टर पर टकराती है, तो हम एक बीएफ छवि रिकॉर्ड करते हैं जहां (इलेक्ट्रॉन-प्रकीर्णन) नमूना अंधेरा दिखाई देता है; इसके विपरीत, जब डिटेक्टर केवल बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों को इकट्ठा करता है, तो हम एक डीएफ छवि रिकॉर्ड करते हैं जहां घना नमूना उज्ज्वल दिखाई देता है। जब उपयुक्त हार्डवेयर उपलब्ध होता है, तो सीरियलईएम इन दोनों संकेतों को एक साथ प्राप्त और रिकॉर्ड कर सकता है। अभी भी अधिक परिष्कृत कॉन्फ़िगरेशन उपलब्ध हैं, जिसमें कई खंडों वाले डिटेक्टरों से लेकर पूरी तरह से पिक्सेलेटेड कैमरे शामिल हैं। चरण कंट्रास्ट इमेजिंग को प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, ऑफ-एक्सिस डिटेक्टर तत्वों32,33 के बीच अंतर का मूल्यांकन करके। प्रति पिक्सेल पूरे 2 डी प्रकीर्णन (विवर्तन) पैटर्न को एकत्र करना 4 डी एसटीईएम34 के रूप में जानी जाने वाली विधि को परिभाषित करता है, जो एक ही मूल डेटा से कई छवि विरोधाभासों के पुनर्निर्माण को सक्षम बनाता है। चार-आयामी एसटीईएम इलेक्ट्रॉन पीटीचोग्राफी को सक्षम करता है, जो चरण कंट्रास्ट35 प्राप्त करने के लिए एक और साधन प्रदान करता है।
हमने विशेष एसटीईएम पद्धति पर ध्यान केंद्रित किया है जिसे हम ऑर्गेनेल और बरकरार कोशिकाओं या माइक्रोन-मोटी सेल वर्गों के अध्ययन के लिए सबसे उपयोगी मानते हैं। यह विशेष रूप से रोशनी में एक छोटे अर्ध-अभिसरण कोण और डिटेक्टर पर अपेक्षाकृत बड़े संग्रह कोण के साथ बीएफ इमेजिंग के उपयोग पर जोर देता है। छोटा अभिसरण क्षेत्र की एक बड़ी गहराई प्रदान करता है ताकि पूरा नमूना झुकाव श्रृंखला19 के दौरान फोकस में रहे। व्यवहार में, एक अच्छे माइक्रोस्कोप चरण के साथ, यह अधिग्रहण के दौरान फोकस समायोजन की आवश्यकता को भी समाप्त कर सकता है। कीमत समाधान में एक समझौता है, जैसा कि प्रोटोकॉल की धारा 3 में वर्णित है। हमने ~ 2 एनएम की जांच के साथ 4k छवियों का सुझाव दिया है, जो 1 एनएम पिक्सेल स्पेसिंग के साथ 4 μm के दृश्य के क्षेत्र तक पहुंचता है। हालांकि, पाठक को प्रयोग करने के लिए दृढ़ता से प्रोत्साहित किया जाता है। दूसरा विचार डिटेक्टर के पक्ष में है। जब रोशनी डिस्क ऑन-एक्सिस बीएफ डिटेक्टर को कम करती है, तो चरण कंट्रास्ट दबा दिया जाता है और प्रकीर्णन (आयाम) कंट्रास्ट हावी होता है; इस स्थिति को असंगत उज्ज्वल क्षेत्र कंट्रास्ट36 कहा गया है। सवाल यह है कि किस अंश से कम भरना है, और उत्तर नमूने पर निर्भर करता है। एक बहुत पतला नमूना डिटेक्टर के साथ पूरी तरह से भरे हुए (यानी, रोशनी से मेल खाने वाला संग्रह कोण) के साथ सबसे अच्छा कंट्रास्ट दिखाएगा, लेकिन एक मोटा नमूना सभी तीव्रता को दूर कर देगा, जिससे खराब कंट्रास्ट के साथ शोर का संकेत छोड़ दिया जाएगा। अंगूठे का एक उपयोगी नियम यह है कि नमूना जितना मोटा होगा, बीएफ डिटेक्टर का बाहरी कटऑफ कोण21 होना चाहिए। डिटेक्टर आकार और स्थिति निश्चित रूप से तय की जाती है, इसलिए विवर्तन डिस्क आकार को कैमरे की लंबाई का उपयोग करके समायोजित किया जाता है, जैसा कि अनुभाग 1 में वर्णित है। यदि डिटेक्टर एम्पलीफायर सेटिंग्स ऐसी हैं कि सिग्नल गतिशील सीमा को भरता है लेकिन प्रत्यक्ष रोशनी (1.12.3) के तहत संतृप्त नहीं होता है, तो कैमरे की लंबाई को तब तक बढ़ाया जा सकता है जब तक कि उचित सिग्नल तीव्रता और कंट्रास्ट तक नहीं पहुंच जाता। फिर, पाठक को प्रयोग करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। कला, इसलिए बोलने के लिए, कोणों में है।
एक और पैरामीटर, प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं की गई है, माइक्रोस्कोप त्वरण वोल्टेज है। नमूने के साथ रोशन इलेक्ट्रॉनों की बातचीत कम वोल्टेज पर मजबूत होगी। बाकी सब समान होने के साथ, हम कम वोल्टेज पर उच्च कंट्रास्ट की उम्मीद कर सकते हैं। दूसरी ओर, यह नमूने के भीतर कई प्रकीर्णन की शुरुआत है जो उपयोग योग्य नमूना मोटाई को सीमित करता है, इसलिए एक उच्च वोल्टेज मोटे नमूनों के उपयोग की अनुमति देता है। हालांकि, ये प्रभाव सूक्ष्म हैं। 200 केवी और 300 केवी त्वरण के साथ आज तक के हमारे अनुभव समान हैं।
यह देखते हुए कि रिज़ॉल्यूशन के संदर्भ में एसटीईएम से क्या उम्मीद की जा सकती है, यह फिर से नमूना और डिटेक्टर कॉन्फ़िगरेशन पर निर्भर करता है। एकल कण विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करके, फेरिटिन पर धातु आयनों को कुछ एंगस्ट्रॉम37 की सटीकता के लिए वलयाकार डार्क फील्ड एसटीईएम द्वारा स्थानीयकृत किया जा सकता है। हाल ही में, एकीकृत अंतर चरण कंट्रास्ट (आईडीपीसी) एसटीईएम32 के साथ-साथ पीटीचोग्राफी35 द्वारा प्राप्त छवियों का उपयोग करके वायरस और प्रोटीन नमूनों के लिए उप-नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन हासिल किया गया था। मोटे सेलुलर नमूनों में अद्वितीय वस्तुओं के लिए, और यहां वर्णित विधियों के साथ, इस तरह के उच्च रिज़ॉल्यूशन यथार्थवादी नहीं है। इष्टतम रिज़ॉल्यूशन जांच व्यास है, जो वर्णित अर्ध-अभिसरण कोण से संबंधित है। अन्य कारक रिज़ॉल्यूशन को कम कर देंगे, विशेष रूप से एक बड़े क्षेत्र तक पहुंचने के लिए एक मोटे पिक्सेल नमूनाकरण, झुकाव श्रृंखला में गलत संरेखण और ट्रांसमिशन में जांच बीम का प्रसार। छवियां प्लास्टिक सेक्शन टोमोग्राफी के साथ अच्छी तरह से तुलना करती हैं। यहां वर्णित सेटअप के साथ, उदाहरण के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं के खोखले कोर को देखना आसान होना चाहिए, लेकिन व्यक्तिगत प्रोटोफिलामेंट्स नहीं।
संक्षेप में, एसटीईएम विधियां और हार्डवेयर दोनों एक विकास चरण में हैं। हम उम्मीद कर सकते हैं कि इमेजिंग में नवाचार टोमोग्राफी को भी प्रभावित करेंगे, एसटीईएम को उन डोमेन में ले जाएंगे जो अन्य तकनीकों द्वारा सुलभ नहीं हैं। हम उम्मीद करते हैं कि आधुनिक ऑप्टिकल सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियों के आधार पर कोररिलेटिव क्रायोजेनिक फ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ अभिसरण विशेष रूप से फलदायी होगा। ऑर्गेनेल का पैमाना, 100-1,000 एनएम, इन उभरते तरीकों के लिए एक आदर्श लक्ष्य है।
The authors have nothing to disclose.
हम सीरियलईएम सॉफ्टवेयर पैकेज के लेखक और रखरखावकर्ता, डेविड मैस्ट्रोनाड और गुंथर रेश से निरंतर और निरंतर समर्थन के लिए बेहद आभारी हैं। पी.के. को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) द्वारा श्रोडिंगर फैलोशिप जे 4449-बी के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था। खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखकों ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए सीसी-बीवाई सार्वजनिक कॉपीराइट लाइसेंस लागू किया है। एमई और एसजीडब्ल्यू इजरायल साइंस फाउंडेशन, अनुदान संख्या 1696/18 और यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 ट्विनिंग परियोजना, इम्पैक्ट (अनुदान संख्या 857203) से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं। एमई क्रायोस्टेम परियोजना (अनुदान संख्या 101055413) में ईआरसी से वित्त पोषण स्वीकार करता है। एमई सैम और अयाला ज़ैक्स प्रोफेसरल चेयर के पदधारी और नैनो और बायो-नैनो इमेजिंग के लिए इरविंग और चेरना मोस्कोविट्ज़ सेंटर के प्रमुख हैं। एमई की प्रयोगशाला को हेरोल्ड पर्लमैन परिवार की ऐतिहासिक उदारता से लाभ हुआ है। हम यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषण को भी स्वीकार करते हैं। व्यक्त किए गए विचार और राय केवल लेखक (ओं) के हैं और जरूरी नहीं कि यूरोपीय संघ या यूरोपीय अनुसंधान परिषद कार्यकारी एजेंसी के हों। न तो यूरोपीय संघ और न ही अनुदान देने वाले प्राधिकरण को उनके लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।
SerialEM | University of Colorado | Veriosn 4.0 | SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. |
STEM-capable transmission electron microscope | The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well. |