Kryo-STEM-tomografi gir et middel til å visualisere organeller av intakte celler uten innebygging, seksjonering eller andre invasive preparater. Den oppnådde 3D-oppløsningen ligger for tiden i området noen få nanometer, med et synsfelt på flere mikrometer og en tilgjengelig tykkelse i størrelsesorden 1 μm.
Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) er avhengig av avbildning av biologiske eller organiske prøver innebygd i deres opprinnelige vandige medium; Vann størknes til et glass (dvs. vitrifisert) uten krystallisering. Kryo-EM-metoden er mye brukt til å bestemme strukturen av biologiske makromolekyler nylig ved en nær atomoppløsning. Tilnærmingen har blitt utvidet til studiet av organeller og celler ved hjelp av tomografi, men den konvensjonelle modusen for bredfeltsoverføring EM-avbildning lider av en alvorlig begrensning i prøvetykkelsen. Dette har ført til en praksis med å frese tynne lameller ved hjelp av en fokusert ionstråle; Den høye oppløsningen oppnås ved subtomogram gjennomsnitt fra rekonstruksjonene, men tredimensjonale relasjoner utenfor det gjenværende laget går tapt. Tykkelsesbegrensningen kan omgås ved skannet sondebildebehandling, som ligner på skanning EM eller konfokal laserskanningsmikroskop. Mens skanning av transmisjonselektronmikroskopi (STEM) i materialvitenskap gir atomoppløsning i enkeltbilder, krever følsomheten til kryogene biologiske prøver for elektronbestråling spesielle hensyn. Denne protokollen presenterer et oppsett for kryotomografi ved hjelp av STEM. Den grunnleggende topiske konfigurasjonen av mikroskopet er beskrevet for både to- og tre-kondensatorsystemer, mens automatisering leveres av den ikke-kommersielle SerialEM-programvaren. Forbedringer for batchoppkjøp og korrelativ justering til tidligere ervervede fluorescenskart er også beskrevet. Som et eksempel viser vi rekonstruksjonen av en mitokondrion, som peker på den indre og ytre membranen og kalsiumfosfatgranulatet, samt omkringliggende mikrotubuli, aktinfilamenter og ribosomer. Kryo-STEM-tomografi utmerker seg ved å avsløre organellteateret i cytoplasma og i noen tilfeller til og med den nukleære periferien av adherente celler i kultur.
Tredimensjonal (3D) visualisering av organeller er en viktig oppgave i moderne cellebiologi. Gitt skalaene som er involvert, alt fra titalls nanometer for sekretoriske vesikler til mange mikron for cellekjernen, er det utfordrende å finne en enkelt mikroskopiteknikk som passer til alle applikasjoner. Mens moderne fluorescensmikroskopi kan spenne over mye av området når det gjelder oppløsning, vises bare de merkede molekylene. Det cellulære teatret forblir riket for elektronmikroskopi. Konvensjonelle metoder for kjemisk fiksering, plastinnstøping og farging med tungmetaller er sterkt invasive, så resultatene kan avhenge av detaljene i prøveprepareringen. Cryo-EM, derimot, er begrenset av behovet for å vitrifisere det vandige medium; Iskrystaller som danner diffrakterer elektronbelysningen, noe som forårsaker kontrastartefakter med høyere kontrast enn det organiske materialet av interesse.
Det siste tiåret har sett en spredning av EM-bildebehandlingsteknikker utviklet eller tilpasset for cellulære studier1. Høytrykksfrysing kombinert med iterativ fokusert ionstråle (FIB) fresing og seriell overflateavbildning ved hjelp av skanningelektronmikroskopet (dvs. FIB-SEM) er for tiden den valgte metoden for store prøver2. Kryogen myk røntgentomografi (cryo-SXT) er egnet for prøver av flere mikron i størrelse, begrenset av den karakteristiske absorpsjonslengden til de myke røntgenstrålene i vann 3,4,5. Denne skalaen inneholder mange intakte celletyper, og den kvantitative naturen til røntgenabsorpsjonskontrasten legger til et aspekt av konsentrasjonsmåling6 eller spektroskopi7. Når det kombineres med subtomogramgjennomsnitt, gir kryotransmisjonselektrontomografi (kryo-ET), basert på fasekontrasttransmisjonselektronmikroskopi (TEM), den høyeste oppløsningen for makromolekyler eller komplekser 8,9,10. Det er imidlertid sjelden at intakte organeller er så vanlige at de kan gjennomsnittes hele. Videre er den konvensjonelle modusen for bredfelt-TEM begrenset for prøvetykkelse til noen få hundre nanometer ved kombinasjonen av uelastisk spredning (som involverer energitap) i prøven og kromatisk aberrasjon i den magnetiske objektivlinsen11,12. Den store energispredningen dikterer bruken av et energifilter for å fjerne den resulterende ufokuserte disen, men den følsomme prøven lider fortsatt av strålingsskade mens bildesignalet blir eksponentielt svakere med økende tykkelse.
Den alternative avbildningsmodusen, scanning transmission EM (STEM), omgår behovet for energifiltrering og beholder de uelastisk spredte elektronene for bildedannelse, om enn for tiden i en lavere oppløsning enn for TEM-tomografi (figur 1). Faktisk dannes ikke noe ekte bilde. I stedet, som i en skanning EM, blir målinger gjort punkt for punkt, og bildet er samlet av datamaskinen. Forstørrelsen bestemmes bare av størrelsen på skannetrinnene uten å endre linsestrømmene. Når det er riktig konfigurert, kan det nyttige prøvetykkelsesområdet for kryo-STEM-tomografi (CSTET) nå 1,5 eller til og med 2 μm, selv om komfortsonen, der den nyttige signalintensiteten forblir en betydelig del av belysningen, er rundt 600-900 nm11,13. Dette er tilstrekkelig til å se en stor del av cytoplasma, og av og til en kant av cellekjernen. I praksis finner vi at vitrifisering ved standardmetoden for å stupe ned i kryogen væske legger en strengere begrensning på tykkelsen enn STEM-avbildning. Målet med denne videoartikkelen er å lette innlemmelsen av CSTET i verktøykassen for celle- og organellavbildning i forskningslaboratorier og mikroskopianlegg.
Den første utfordringen er at mikroskopoperasjoner i CSTET ennå ikke er standardisert for biovitenskapelige applikasjoner på samme måte som de har vært for kryo-TEM-tomografi. STEM-maskinvare har sjelden (eller aldri) vært målrettet mot kryo-EM-markedet. Dette endrer seg imidlertid med den nyeste generasjonen mikroskoper, og mange eksisterende verktøy kan ettermonteres. STEM som teknikk har tatt av og i stor grad tatt over i materialvitenskapene, hvor det også er spirende interesse for kryogene og lavdosemetoder14,15. Materialvitenskapslitteraturen florerer med akronymer BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., som legger til forvirringen. Vi tilbyr her et anbefalt utgangspunkt som, i vår kollektive erfaring ved Weizmann Institute of Science, gir den mest generelle protokollen for nyttige resultater basert på bright field (BF) STEM-avbildning16. På ingen måte eksos det eller til og med utforske omfanget av muligheter, men det vil tjene som grunnlag for ytterligere forbedringer. Mens vi legger vekt på kryo-STEM, er det meste av protokollen like relevant for romtemperatur STEM-tomografi av plast-innebygde seksjoner.
Essensen av STEM er å skanne prøven med en fokusert elektronsonde (figur 1), belysningskjeglen, og å registrere signaler fra diffraksjonsplanet (spredning) i overføring, piksel for piksel, for å produsere 2D-bilder17,18. Amorfe prøver, inkludert de fleste cellulære materialer, vil produsere et diffust spredningsmønster i overføring. Den enkleste praktiske STEM-konfigurasjonen er å plassere en sirkulær detektor for å registrere den sentrale disken (dvs. sondebelysningen som vil bli overført uten prøve). Prøven sprer elektroner bort fra denne belysningskjeglen i den grad signalet avtar. Dette gir et BF-bilde – prøven ser mørk ut på en lys bakgrunn. En ringformet detektor kan også (eller i stedet) brukes til å oppdage spredningen fra prøven utenfor belysningskjeglen. Når prøven er fjernet, er det ikke noe signal. Når et eksemplar er på plass, vises objekter lyse på en mørk bakgrunn i bildet av det mørke feltet (DF). Nomenklaturen for STEM (BF, ringformet mørkt felt [ADF], høyvinklet ringformet mørkt felt [HAADF], etc.) refererer hovedsakelig til områdene av innsamlingsvinkler for detektorene.
Konvergensvinkelen til belysningen representerer en viktig tilpasning av STEM til cellulær tomografi. Når toppprioriteten er høy oppløsning, bør konvergensvinkelen være så stor som mulig. (Dette ligner på konfokal laserskanningsmikroskopi; oppløsningen bestemmes av sondediameteren, som skalerer som bølgelengden dividert med den numeriske blenderåpningen. Merk at vi refererer til halvvinkel- eller halvkonvergensvinkelen for EM.) Når prioriteten er dybdeskarpheten, derimot, gir et kompromiss i oppløsning en stor fordel, da den fokuserte strålen forblir omtrent parallell i en avstand som er lik to ganger bølgelengden delt på halvvinkelkvadrat. Ideelt sett forblir hele cellevolumet i fokus19. For eksempel, ved 300 keV, er elektronen deBroglie bølgelengde 0, 002 nm, så en konvergens på 1 mrad gir en oppløsning på 2 nm og en dybdeskarphet på 4 mikron. Under disse forholdene kan tomografi utføres selv uten å fokusere under datainnsamlingsprosessen, men bare en gang i begynnelsen av oppkjøpet. En konvensjonell tomografi-stand STEM kan nå en semi-konvergens vinkel på 7 eller 8 mrad; Derfor kunne vi i prinsippet nå en oppløsning i størrelsesorden 0.25 nm, men da med en brennvidde på bare 62 nm. Dette er tydeligvis for tynt for cellulær bildebehandling. Mer avanserte mikroskoper med tre kondensatorlinser gir kontinuerlig justering av semi-konvergensvinkelen over et betydelig område. Med den mer tradisjonelle to-kondensatorkonfigurasjonen bestemmes konvergensen diskret av kondensatoråpningen (C2).
For robuste, plastinnebygde prøver kan man registrere en fokalserie ved hver tilt og kombinere dem for høy oppløsning20, men for kryogene prøver er strålingsbudsjettet for sterkt begrenset. Til slutt, når man veier fordelene med BF- eller DF-avbildning, for tykke prøver, bør man vurdere effekten av flere elastiske spredning i prøven. BF-signalet er mindre ødelagt av flere spredninger og viser en høyere oppløsning for tykke prøver16,21.
En nyttig tommelfingerregel har vært å sette samlingsvinkler flere ganger større enn konvergens. Jo tykkere prøven er, desto større skal samlingsdisken være. For liten disk vil gi lav signalintensitet; For stor disk vil føre til dårlig bildekontrast, da bare spredning med høyest vinkel vil bidra. Oppsamlingsvinklene bør optimaliseres for en gitt prøve. Detektorvinklene som funksjon av (diffraksjon) kameralengde må kalibreres uavhengig. De kan vises praktisk av mikroskopprogramvaren. I praksis er en faktor på to til fem i forholdet mellom innsamling og belysningshalvvinkler, henholdsvis θ og α (figur 1), et anbefalt utgangspunkt for CSTET av cellulære prøver.
Følgende protokoll beskriver STEM-tomografioperasjon ved hjelp av den populære SerialEM-programvaren for mikroskopkontroll22,23. SerialEM er ikke knyttet til en bestemt produsent, og den er mye brukt i TEM-tomografi. De fleste operasjonene i å sette opp for tomografi kan overføres direkte fra TEM. SerialEM-strategien er å modellere skannesystemet som et kamera. Dette muliggjør den enkle crossoveren fra TEM til STEM. Man bør imidlertid huske på at parametere som forstørrelse og binning er helt kunstige. De viktige parametrene er synsfeltet i mikron, antall piksler i synsfeltet og eksponeringstiden. Pikselavstanden, eller samplingen, er det lineære feltet delt på antall piksler, mens oppholdstiden er antall piksler delt på eksponeringstiden.
Minimumskonfigurasjonen for STEM og CSTET innebærer tre funksjoner på mikroskopet: en skannegenerator, en STEM-detektor og tomografikontrollprogramvare. Protokollen viser til nomenklaturen til FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), men begrepene er generiske. Den proprietære programvaren til TFS er beskrevet i JoVE for TEM24, og STEM-operasjonen er veldig lik.
Vi antar at mikroskopet har blitt justert på forhånd av serviceteamet eller erfarne medarbeidere, og at en kolonnejustering kan hentes opp ved å laste inn en fil. Mindre justeringer kalles direkte justeringer og kan lagres i såkalte FEG-registre (TFS-mikroskop). Direkte justeringer inkluderer rotasjonssenter, pivotpunkter, diffraksjonsjustering og kompensasjon for kondensator astigmatisme. Justeringer må utføres iterativt. Merk at TFS-mikroskoper implementerer forskjellige nanoprobe (nP) og mikrosonde (μP) modus; for en gitt kondensatoråpning gir disse et relativt smalt eller bredt synsfelt med parallell belysning i TEM og en mer eller mindre konvergent (tett fokusert) elektronstråle i STEM. Andre produsenter bruker forskjellige ordninger for å dekke rekkevidden av konvergensvinkler.
Før du starter, bør synsfeltet, L og prøvetakingen (pikselbredde), l, velges, avhengig av prøven som studeres. For eksempel, for l = 1 nm / piksel, bør et bilde på 4 000 x 4 000 piksler som dekker et synsfelt 4 μm2 velges. Oppløsningen vil i beste fall være det dobbelte av romlig prøvetaking, så 2 nm, og sondediameteren, d, skal samsvare med det. Kalibrering av sondevinkelen er utenfor omfanget av denne protokollen, så vi antar at en tabell eller en skjermavlesning er tilgjengelig. Sondediameteren er omtrent elektronbølgelengden dividert med halvkonvergensvinkelen (i radianer): d = λ/θ. Bølgelengden, λ, er 0,002 nm for 300 keV og 0,0025 nm for 200 keV elektroner, så θ på 1 mrad vil gi en punktdiameter på henholdsvis 2 eller 2,5 nm.
Protokollen presenteres i en progresjon av økende kompleksitet. Den første oppgaven er å produsere et STEM-bilde, som avhenger av mikroskopprodusentens programvare, og deretter en vippeserie, som vi bruker SerialEM til. Mange lesere vil utvilsomt være kjent med SerialEM, så de mer kompliserte oppgavene kommer naturlig. Det er ikke nødvendig å følge prosedyrene strengt. Utviklingen knyttet til automatisering kan implementeres direkte for STEM så vel som for TEM. Erfarne brukere vil sannsynligvis invertere protokollen, som begynner med korrelativ registrering av fluorescenskart og fortsetter å sette opp batchtomografi. Ytterligere detaljer finner du i de omfattende dokumentasjons- og opplæringsbibliotekene for SerialEM selv, inkludert en nylig JoVE-artikkel om den siste utviklingen innen automatisering25.
Protokollen skal hjelpe biovitenskapelige mikroskopister som er interessert i å få en 3D-visning av intracellulære organeller i regioner av cellen som ikke er tilgjengelige for konvensjonell TEM-tomografi. Den samme protokollen kan også brukes for STEM-tomografi av plastseksjoner, med avslappede begrensninger på eksponeringen. Protokollen bør betraktes som et utgangspunkt snarere enn et sett med harde regler. Faktisk er kraften til STEM dens fleksibilitet; Det er ingen riktig måte å betjene den på.
Vi understreker at STEM i seg selv kun refererer til den skannede sonden og ikke definerer bildedannelsen. Kontrasten avhenger hovedsakelig av konfigurasjonen av detektorer. De mer enkle metodene benytter detektorer med aksial symmetri, enten en disk sentrert på den optiske aksen eller et ringrom som omgir den. Generelt, når belysningen treffer detektoren direkte, registrerer vi et BF-bilde der (elektronspredning) prøven ser mørk ut; Omvendt, når detektoren bare samler spredte elektroner, registrerer vi et DF-bilde der det tette eksemplaret ser lyst ut. Når egnet maskinvare er tilgjengelig, kan SerialEM anskaffe og registrere begge disse signalene samtidig. Enda mer sofistikerte konfigurasjoner er tilgjengelige, alt fra detektorer med flere segmenter til fullt pikselerte kameraer. Avbildning av fasekontrast kan for eksempel oppnås ved å evaluere forskjellen mellom off-axis detektorelementer32,33. Innsamling av hele 2D-spredningsmønsteret (diffraksjon) per piksel definerer metoden kjent som 4D STEM34, som muliggjør rekonstruksjon av flere bildekontraster fra de samme opprinnelige dataene. Firedimensjonal STEM muliggjør elektronptykografi, som gir et annet middel for å oppnå fasekontrast35.
Vi har fokusert på den spesielle STEM-modaliteten som vi anser for å være mest nyttig for studiet av organeller og intakte celler eller mikrontykke celleseksjoner. Dette innebærer spesifikt bruk av BF-avbildning med liten semi-konvergensvinkel i belysningen og en relativt stor oppsamlingsvinkel ved detektoren. Den lille konvergensen gir stor dybdeskarphet slik at hele prøven forblir i fokus gjennom hele vippeserien19. I praksis, med et godt mikroskopstadium, kan det også eliminere behovet for fokusjustering under oppkjøpet. Prisen er et kompromiss i oppløsning, som beskrevet i punkt 3 i protokollen. Vi har foreslått 4k-bilder med en sonde på ~ 2 nm, som med 1 nm pikselavstand når et synsfelt på 4 μm. Leseren oppfordres imidlertid sterkt til å eksperimentere. Det andre hensynet er på siden av detektoren. Når belysningsdisken underfyller BF-detektoren på aksen, undertrykkes fasekontrast og spredning (amplitude) kontrast dominerer; Denne tilstanden har blitt kalt usammenhengende lysfeltkontrast36. Spørsmålet er hvilken brøkdel som skal underfylles, og svaret avhenger av utvalget. En veldig tynn prøve vil vise best kontrast med detektoren fullstendig fylt (dvs. oppsamlingsvinkelen som samsvarer med belysningen), men en tykkere prøve vil spre all intensiteten bort, og etterlate et støyende signal med dårlig kontrast. En nyttig tommelfingerregel er at jo tykkere prøven er, desto større er den ytre grensevinkelen til BF-detektoren21. Detektorens størrelse og posisjon er selvfølgelig fast, så størrelsen på diffraksjonsdisken justeres ved hjelp av kameralengden, som beskrevet i avsnitt 1. Hvis innstillingene for detektorforsterkeren er slik at signalet fyller det dynamiske området, men ikke metter under direkte belysning (1.12.3), kan kameralengden økes til en rimelig signalintensitet og kontrast er nådd. Igjen oppfordres leseren til å eksperimentere. Kunsten ligger så å si i vinklene.
En annen parameter, som ikke er omtalt i protokollen, er mikroskopets akselerasjonsspenning. Samspillet mellom de lysende elektronene og prøven vil bli sterkere ved lavere spenning. Med alt annet likt kan vi forvente høyere kontrast ved lavere spenning. På den annen side er det utbruddet av flere spredninger i prøven som begrenser den brukbare prøvetykkelsen, så en høyere spenning tillater bruk av tykkere prøver. Disse effektene er imidlertid ganske subtile. Våre erfaringer så langt med 200 kV og 300 kV akselerasjoner er like.
Med tanke på hva som kan forventes av STEM når det gjelder oppløsning, avhenger dette igjen av prøven og detektorkonfigurasjonen. Ved hjelp av en enkelt partikkelanalysetilnærming kunne metallioner på ferritin lokaliseres med ringformet mørkt felt STEM til en presisjon på noen få angstrom37. Mer nylig ble sub-nanometeroppløsning oppnådd for virus- og proteinprøver ved hjelp av bilder oppnådd ved integrert differensialfasekontrast (iDPC) STEM32 samt ptykografi35. For unike objekter i tykke cellulære prøver, og med metodene beskrevet her, er så høy oppløsning ikke realistisk. Den optimale oppløsningen er sondediameteren, som relaterer seg til semi-konvergensvinkelen som beskrevet. Andre faktorer vil redusere oppløsningen, spesielt en grov pikselsampling for å nå et stort synsfelt, feiljusteringer i vippeserien og spredning av sondestrålen i overføring. Bilder sammenligner godt med plastseksjonstomografi. Med oppsettet beskrevet her, for eksempel, bør det være lett å se den hule kjernen i mikrotubuli, men ikke de enkelte protofilamentene.
For å oppsummere er både realfagsmetoder og maskinvare i en utviklingsfase. Vi kan forvente at innovasjoner innen bildebehandling også vil påvirke tomografi, og føre STEM inn i domener som ikke har vært tilgjengelige med andre teknikker. Vi forventer at en konvergens med korrelativ kryogen fluorescensavbildning basert på moderne optiske superoppløsningsmetoder vil være spesielt fruktbar. Skalaen av organeller, 100-1000 nm, er et ideelt mål for disse nye metodene.
The authors have nothing to disclose.
Vi er svært takknemlige for den kontinuerlige og konstante støtten fra forfatteren og vedlikeholderen av SerialEM-programvarepakken, David Mastronade, og Günther Resch. PK ble finansiert av Austrian Science Fund (FWF) gjennom et Schrödinger Fellowship J4449-B. For formålet med åpen tilgang har forfatterne brukt en CC-BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen. M.E. og S.G.W. anerkjenner finansiering fra Israel Science Foundation, grant no.1696/18, og fra European Union Horizon 2020 Twinning-prosjektet, ImpaCT (grant no.857203). M.E. anerkjenner finansiering fra ERC i CryoSTEM-prosjektet (grant no. 101055413). ME er den sittende av Sam og Ayala Zacks professorstol og leder av Irving og Cherna Moskowitz Center for Nano og Bio-Nano Imaging. Laboratoriet til ME har dratt nytte av den historiske generøsiteten til Harold Perlman-familien. Vi anerkjenner også finansieringen fra EU. Synspunkter og meninger som uttrykkes er imidlertid bare forfatterens/forfatternes, og reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene til EU eller Det europeiske forskningsrådets utøvende organ. Verken EU eller den bevilgende myndighet kan holdes ansvarlig for dem.
SerialEM | University of Colorado | Veriosn 4.0 | SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. |
STEM-capable transmission electron microscope | The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well. |