Concentrazione di particelle virali da campioni di acqua ambientale e acque reflue mediante flocculazione e ultrafiltrazione del latte scremato

Summary

La concentrazione di virus da campioni di acqua ambientale e acque reflue è un compito impegnativo, svolto principalmente per l’identificazione e la quantificazione dei virus. Mentre diversi metodi di concentrazione del virus sono stati sviluppati e testati, dimostriamo qui l’efficacia dell’ultrafiltrazione e della flocculazione del latte scremato per i virus a RNA con diversi tipi di campioni.

Abstract

L’epidemiologia basata sull’acqua e sulle acque reflue è emersa come metodi alternativi per monitorare e prevedere il corso delle epidemie nelle comunità. Il recupero di frazioni microbiche, inclusi virus, batteri e microeucarioti dalle acque reflue e dai campioni di acqua ambientale è uno dei passaggi impegnativi in questi approcci. In questo studio, ci siamo concentrati sull’efficienza di recupero dell’ultrafiltrazione sequenziale e dei metodi di flocculazione del latte scremato (SMF) utilizzando l’RNA corazzato come virus di prova, che viene anche utilizzato come controllo da alcuni altri studi. La prefiltrazione con filtri a disco a membrana da 0,45 μm e 0,2 μm è stata applicata per eliminare le particelle solide prima dell’ultrafiltrazione per prevenire l’intasamento dei dispositivi di ultrafiltrazione. I campioni di prova, elaborati con il metodo dell’ultrafiltrazione sequenziale, sono stati centrifugati a due diverse velocità. Una maggiore velocità ha comportato minori tassi di recupero e positività dell’RNA corazzato. D’altra parte, SMF ha portato a tassi di recupero e positività relativamente coerenti di RNA corazzato. Ulteriori test condotti con campioni di acqua ambientale hanno dimostrato l’utilità di SMF per concentrare altre frazioni microbiche. Il partizionamento dei virus in particelle solide potrebbe avere un impatto sui tassi di recupero complessivi, considerando la fase di prefiltrazione applicata prima dell’ultrafiltrazione dei campioni di acque reflue. SMF con prefiltrazione ha funzionato meglio quando applicato a campioni di acqua ambientale a causa di concentrazioni solide inferiori nei campioni e quindi tassi di ripartizione inferiori ai solidi. Nel presente studio, l’idea di utilizzare un metodo di ultrafiltrazione sequenziale è nata dalla necessità di ridurre il volume finale dei concentrati virali durante la pandemia di COVID-19, quando la fornitura dei dispositivi di ultrafiltrazione comunemente usati era limitata e vi era la necessità di sviluppare metodi alternativi di concentrazione virale.

Introduction

Determinare la concentrazione effettiva di microrganismi nei campioni di superficie e di acque reflue per l’analisi della comunità microbica e gli studi epidemiologici è uno dei passi importanti per monitorare e prevedere il decorso delle epidemie nelle comunità ^1,2. La pandemia di COVID-19 ha rivelato l’importanza di migliorare i metodi di concentrazione. COVID-19 è emerso alla fine del 2019 e, a partire da marzo 2023, rappresenta ancora una minaccia per la salute umana, la vita sociale e l’economia. Strategie efficaci di sorveglianza e controllo per alleviare gli impatti delle epidemie di COVID-19 nelle comunità sono diventate un importante argomento di ricerca, poiché sono emerse nuove ondate e varianti di COVID-19 oltre alla rapida trasmissione e diffusione del virus, nonché casi asintomatici non segnalati e non diagnosticati ^3,4,5. L’uso dell’epidemiologia basata sulle acque reflue per COVID-19 da parte di organizzazioni della società civile, agenzie governative e servizi pubblici o privati è stato utile per fornire rapidamente informazioni relative all’epidemia e mitigare gli impatti delle epidemie di COVID-19 6,7,8,9. Tuttavia, la concentrazione di SARS-CoV-2, un virus RNA avvolto, nei campioni di acque reflue pone ancora sfide¹⁰. Ad esempio, una di queste sfide è la ripartizione di SARS-CoV-2 nei solidi delle acque reflue, che può influire sul recupero quando i solidi vengono eliminati durante la concentrazione¹¹. In tal caso, la quantificazione/valutazione dovrebbe concentrarsi sia sulla fase solida che su quella acquosa dei campioni di acqua ambientale, piuttosto che sulla sola fase acquosa. Inoltre, la scelta del metodo di concentrazione può essere modificata sulla base di prove e analisi a valle. La concentrazione di particelle virali e agenti patogeni da campioni ambientali è diventata un argomento di ricerca urgente con sviluppi nei campi del sequenziamento e del microbioma.

Vari metodi di concentrazione del virus sono stati applicati nel campo della concentrazione di virus da campioni di acque ambientali e acque reflue. Alcuni metodi comunemente usati sono la filtrazione, la flocculazione del latte scremato (SMF), l’adsorbimento / eluizione e la precipitazione del glicole polietilenico^12-17. Tra questi, SMF è stato considerato un metodo economico ed efficace, testato con successo e applicato per il recupero di virus, tra cui SARS-CoV-2, dalle acque reflue e superficiali^12,15,16,18. La procedura SMF è un approccio relativamente nuovo che ha ottenuto un maggiore riconoscimento tra molti studi ambientali come metodologia appropriata per recuperare simultaneamente una vasta gamma di microrganismi come virus, batteri e protozoi da tutti i tipi di campioni di acqua, vale a dire fanghi, acque reflue grezze, acque reflue e campioni di effluenti¹⁹. Rispetto ad altre metodologie note per recuperare virus da campioni ambientali come l’ultrafiltrazione e l’eluizione glicina-alcalina, l’approccio basato sulla liofilizzazione o l’ultracentrifugazione e l’eluizione glicina-alcalina, SMF è stato segnalato come il metodo più efficiente con tassi di recupero e rilevamento virali più elevati^18,20. Nel presente studio, abbiamo utilizzato l’RNA corazzato come virus di prova per valutare l’efficienza di recupero dei metodi di concentrazione del virus, compresi i test per valutare il recupero di SARS-CoV-2^21,22.

Qui, abbiamo testato campioni di acque reflue e acque ambientali per dimostrare l’utilità di SMF e un metodo di ultrafiltrazione sequenziale per concentrare le frazioni microbiche per la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), la metagenomica basata sulla sequenza e il sequenziamento dell’amplicone profondo. SMF è un metodo relativamente più economico e ottimale per un volume maggiore di campioni rispetto ai metodi di ultrafiltrazione. L’idea di utilizzare un metodo di ultrafiltrazione sequenziale è nata dalla necessità di ridurre il volume finale dei concentrati virali durante la pandemia di COVID-19, quando la fornitura dei dispositivi di ultrafiltrazione comunemente usati era limitata e c’era la necessità di sviluppare metodi alternativi di concentrazione virale.

Protocol

1. Confronto tra ultrafiltrazione seriale e flocculazione del latte scremato per concentrare virus in campioni di acque reflue Preparazione del campioneRaccogliere 2 L di campioni di acque reflue grezze (influenti) composite proporzionali al flusso di 24 ore. I campioni sono stati raccolti dai tre principali impianti di trattamento delle acque reflue (WWTP) a Winnipeg, in Canada, durante l’estate e l’autunno del 2020 (Tabella 1). Trasportare i campioni in lab…

Representative Results

Valutazione dei metodi di concentrazione dell’RNA viraleTutti e sei i campioni trattati con UF-3k x g sono risultati positivi e hanno determinato un recupero del 13,38% ± dell’8,14% (Figura 1). Solo un campione è risultato positivo quando i campioni sono stati elaborati con UF-7.5k x g. Tutti i campioni trattati con SMF sono risultati positivi e hanno determinato un recupero del 15,27% ± del 2,65% (Figura 1). I tassi med…

Discussion

Uno dei passaggi critici in questo studio è l’eliminazione delle particelle solide applicando una fase di prefiltrazione con filtri a membrana da 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando il partizionamento dei virus in particelle solide, in particolare i virus avvolti, la prefiltrazione può causare una perdita significativa nel recupero virale³⁰. Mentre una fase di prefiltrazione per i metodi di ultrafiltrazione è quasi sempre necessaria per i campioni ambientali e di acque reflue per prevenire l’intas…

Materials

0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump	Masterflex, Cole-Parmer instrument	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH meter	Denver instrument	RK-59503-25	Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen		Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA