Konzentration von Viruspartikeln aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt mittels Magermilchflockung und Ultrafiltration

Summary

Die Viruskonzentration aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die vor allem zur Identifizierung und Quantifizierung von Viren durchgeführt wird. Während mehrere Methoden zur Viruskonzentration entwickelt und getestet wurden, demonstrieren wir hier die Wirksamkeit der Ultrafiltration und der Magermilchflockung für RNA-Viren mit verschiedenen Probentypen.

Abstract

Die wasser- und abwasserbasierte Epidemiologie hat sich als alternative Methode zur Überwachung und Vorhersage des Verlaufs von Ausbrüchen in Gemeinden herausgestellt. Die Rückgewinnung mikrobieller Fraktionen, einschließlich Viren, Bakterien und Mikroeukaryoten, aus Abwasser- und Umweltwasserproben ist einer der herausfordernden Schritte bei diesen Ansätzen. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Rückgewinnungseffizienz von sequenziellen Ultrafiltrations- und Magermilchflockungsmethoden (SMF) unter Verwendung von gepanzerter RNA als Testvirus, das auch von einigen anderen Studien als Kontrolle verwendet wird. Die Vorfiltration mit 0,45 μm und 0,2 μm Membranscheibenfiltern wurde eingesetzt, um Feststoffpartikel vor der Ultrafiltration zu eliminieren und ein Verstopfen der Ultrafiltrationsgeräte zu verhindern. Testproben, die mit der sequentiellen Ultrafiltrationsmethode verarbeitet wurden, wurden mit zwei verschiedenen Geschwindigkeiten zentrifugiert. Eine erhöhte Geschwindigkeit führte zu niedrigeren Wiederfindungs- und Positivitätsraten von gepanzerter RNA. Auf der anderen Seite führte SMF zu relativ konsistenten Wiederfindungs- und Positivitätsraten von gepanzerter RNA. Zusätzliche Tests, die mit Wasserproben aus der Umwelt durchgeführt wurden, zeigten den Nutzen von SMF zur Konzentration anderer mikrobieller Fraktionen. Die Aufteilung von Viren in feste Partikel kann sich auf die Gesamtrückgewinnungsraten auswirken, wenn man den Vorfiltrationsschritt berücksichtigt, der vor der Ultrafiltration von Abwasserproben durchgeführt wird. SMF mit Vorfiltration schnitt bei der Anwendung auf Umweltwasserproben aufgrund geringerer Feststoffkonzentrationen in den Proben und damit geringerer Aufteilungsraten in Feststoffe besser ab. In der vorliegenden Studie entstand die Idee, ein sequentielles Ultrafiltrationsverfahren zu verwenden, aus der Notwendigkeit, das Endvolumen der Viruskonzentrate während der COVID-19-Pandemie zu verringern, als das Angebot an den üblicherweise verwendeten Ultrafiltrationsgeräten begrenzt war und die Entwicklung alternativer Viruskonzentrationsmethoden erforderlich war.

Introduction

Die Bestimmung der effektiven Konzentration von Mikroorganismen in Oberflächen- und Abwasserproben für die Analyse mikrobieller Gemeinschaften und epidemiologische Studien ist einer der wichtigsten Schritte zur Überwachung und Vorhersage des Verlaufs von Ausbrüchen in Gemeinschaften ^1,2. Die COVID-19-Pandemie hat gezeigt, wie wichtig es ist, die Konzentrationsmethoden zu verbessern. COVID-19 trat Ende 2019 auf und stellt im März 2023 immer noch eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit, das soziale Leben und die Wirtschaft dar. Wirksame Überwachungs- und Kontrollstrategien zur Abmilderung der Auswirkungen von COVID-19-Ausbrüchen in Gemeinschaften sind zu einem wichtigen Forschungsthema geworden, da neben der schnellen Übertragung und Ausbreitung des Virus auch neue Wellen und Varianten von COVID-19 sowie nicht gemeldete und nicht diagnostizierte asymptomatische Fälle aufgetaucht sind ^3,4,5. Der Einsatz der abwasserbasierten Epidemiologie für COVID-19 durch zivilgesellschaftliche Organisationen, Regierungsbehörden und öffentliche oder private Versorgungsunternehmen hat sich als hilfreich erwiesen, um schnelle Informationen über den Ausbruch bereitzustellen und die Auswirkungen von COVID-19-Ausbrüchen abzumildern 6,7,8,9. Die Konzentration von SARS-CoV-2, einem behüllten RNA-Virus, in Abwasserproben stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung^{dar 10}. Eine dieser Herausforderungen ist beispielsweise die Aufteilung von SARS-CoV-2 in Abwasserfeststoffen, was sich auf die Rückgewinnung auswirken kann, wenn die Feststoffe während der Konzentration¹¹ eliminiert werden. Wenn dies der Fall ist, sollte der Schwerpunkt der Quantifizierung/Bewertung sowohl auf der festen als auch auf der wässrigen Phase von Umweltwasserproben liegen und nicht nur auf der wässrigen Phase. Darüber hinaus kann die Wahl der Konzentrationsmethode auf der Grundlage nachgelagerter Tests und Analysen modifiziert werden. Die Konzentration von Viruspartikeln und Krankheitserregern aus Umweltproben ist mit Entwicklungen in den Bereichen Sequenzierung und Mikrobiom zu einem dringenden Forschungsthema geworden.

Im Bereich der Viruskonzentration aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt wurden verschiedene Methoden der Viruskonzentration angewendet. Einige häufig verwendete Methoden sind Filtration, Magermilchflockung (SMF), Adsorption/Elution und Polyethylenglykolfällung^12-17. Unter ihnen wurde SMF als kostengünstige und effektive Methode angesehen, erfolgreich getestet und zur Gewinnung von Viren, einschließlich SARS-CoV-2, aus Abwasser und Oberflächengewässern eingesetzt 12,15,16,18. Das SMF-Verfahren ist ein relativ neuer Ansatz, der in vielen Umweltstudien zunehmend als geeignete Methode zur gleichzeitigen Gewinnung eines breiten Spektrums von Mikroorganismen wie Viren, Bakterien und Protozoen aus allen Arten von Wasserproben, nämlich Schlamm, Rohabwasser, Abwasser und Abwasserproben, anerkannt wurde¹⁹. Im Vergleich zu anderen bekannten Methoden zur Rückgewinnung von Viren aus Umweltproben wie Ultrafiltration und Glycin-Alkali-Elution, Lyophilisations-basierter Ansatz oder Ultrazentrifugation und Glycin-Alkali-Elution wurde SMF als die effizienteste Methode mit höheren viralen Rückgewinnungs- und Nachweisraten beschrieben^18,20. In der vorliegenden Studie haben wir gepanzerte RNA als Testvirus verwendet, um die Rückgewinnungseffizienz von Viruskonzentrationsmethoden zu bewerten, einschließlich Tests zur Bewertung der SARS-CoV-2-Erholung^21,22.

Hier testeten wir Abwasser- und Umweltwasserproben, um den Nutzen von SMF und einer sequentiellen Ultrafiltrationsmethode zur Konzentration mikrobieller Fraktionen für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), sequenzbasierte Metagenomik und Deep-Amplicon-Sequenzierung zu demonstrieren. SMF ist eine relativ kostengünstigere Methode und im Vergleich zu Ultrafiltrationsmethoden optimal für ein größeres Probenvolumen. Die Idee, ein sequentielles Ultrafiltrationsverfahren zu verwenden, entstand aus der Notwendigkeit, das Endvolumen der Viruskonzentrate während der COVID-19-Pandemie zu verringern, als das Angebot an den üblicherweise verwendeten Ultrafiltrationsgeräten begrenzt war und die Entwicklung alternativer Viruskonzentrationsmethoden erforderlich war.

Protocol

1. Vergleich von serieller Ultrafiltration und Magermilchflockung zur Aufkonzentrierung von Viren in Abwasserproben ProbenvorbereitungSammeln Sie 2 l 24 h durchflussproportionale zusammengesetzte (Zulauf-)Abwasserproben. Die Proben wurden im Sommer und Herbst 2020 in den drei großen Kläranlagen (ARA) in Winnipeg, Kanada, entnommen (Tabelle 1). Transportieren Sie die Proben in lichtdichten Flaschen in einer Kühlbox ins Labor und verarbeiten Sie sie innerhal…

Representative Results

Evaluierung viraler RNA-KonzentrationsmethodenAlle sechs Proben, die mit UF-3k x g verarbeitet wurden, waren positiv und führten zu einer Gewinnungsrate von 13,38 % ± 8,14 % (Abbildung 1). Nur eine Probe war positiv, wenn die Proben mit UF-7,5k x g bearbeitet wurden. Alle Proben, die mit SMF verarbeitet wurden, waren positiv und führten zu einer Gewinnungsrate von 15,27 % ± 2,65 % (Abbildung 1). Die durchschnittlichen W…

Discussion

Einer der entscheidenden Schritte in dieser Studie ist die Eliminierung von Feststoffpartikeln durch Anwendung eines Vorfiltrationsschritts mit 0,2 μm und 0,45 μm Membranfiltern. In Anbetracht der Aufteilung von Viren in feste Partikel, insbesondere behüllte Viren, kann die Vorfiltration zu einem erheblichen Verlust der Viruserholung führen³⁰. Während bei Umwelt- und Abwasserproben fast immer ein Vorfiltrationsschritt für Ultrafiltrationsmethoden erforderlich ist, um ein Verstopfen von Ultra…

Materials

0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump	Masterflex, Cole-Parmer instrument	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH meter	Denver instrument	RK-59503-25	Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen		Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA