Summary

Aislamiento de vesículas extracelulares de bajo contenido de endotoxinas derivadas de líneas celulares cancerosas

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

El protocolo propuesto incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultivos celulares y cómo evaluarlas adecuadamente.

Abstract

Las vesículas extracelulares (EV) son una población heterogénea de vesículas de membrana liberadas por las células in vitro e in vivo. Su omnipresencia y su importante papel como portadores de información biológica los convierten en objetos de estudio intrigantes, que requieren protocolos confiables y repetitivos para su aislamiento. Sin embargo, darse cuenta de todo su potencial es difícil ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su investigación (como la adquisición adecuada). Este estudio presenta un protocolo para el aislamiento de EVs pequeñas (según la nomenclatura MISEV 2018) a partir del sobrenadante de cultivo de líneas celulares tumorales basado en centrifugación diferencial. El protocolo incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de EV y cómo evaluarlas adecuadamente. La contaminación por endotoxinas de los vehículos eléctricos puede obstaculizar significativamente los experimentos posteriores o incluso enmascarar sus verdaderos efectos biológicos. Por otro lado, la presencia pasada por alto de endotoxinas puede llevar a conclusiones incorrectas. Esto es de particular importancia cuando se refiere a las células del sistema inmune, incluidos los monocitos, porque los monocitos constituyen una población que es especialmente sensible a los residuos de endotoxinas. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente detectar la contaminación por endotoxinas en los EV, especialmente cuando se trabaja con células sensibles a las endotoxinas, como monocitos, macrófagos, células supresoras derivadas de mieloides o células dendríticas.

Introduction

Las vesículas extracelulares (EV), según la nomenclatura MISEV 2018, son un término colectivo que describe varios subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiológicos y patológicos 1,2. Además, los vehículos eléctricos son prometedores como nuevos biomarcadores para diversas enfermedades, así como como agentes terapéuticos y vehículos de administración de fármacos. Sin embargo, realizar todo su potencial es difícil, ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su adquisición3. Uno de esos desafíos es el aislamiento de EV libres de endotoxinas, que se ha descuidado en muchos casos. Una de las endotoxinas más comunes es el lipopolisacárido (LPS), que es un componente importante de las paredes celulares bacterianas gramnegativas y puede causar una respuesta inflamatoria aguda, debido a la liberación de un gran número de citoquinas inflamatorias por varias células 4,5. LPS induce una respuesta mediante la unión a la proteína de unión a LPS, seguida de la interacción con el complejo CD14/TLR4/MD2 en las células mieloides. Esta interacción conduce a la activación de vías de señalización dependientes de MyD88 y TRIF, que a su vez desencadenan el factor nuclear kappa B (NFkB). La translocación de NFkB al núcleo inicia la producción de citoquinas6. Los monocitos y macrófagos son altamente sensibles al LPS, y su exposición al LPS resulta en una liberación de citoquinas inflamatorias y quimiocinas (por ejemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 y TNF-α)7,8. La estructura CD14 permite la unión de diferentes especies de LPS con afinidad similar y sirve como co-receptor para otros receptores tipo toll (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 y 9)6. El número de estudios que se están realizando sobre los efectos de las EV en monocitos/macrófagos sigue aumentando 9,10,11. Especialmente desde la perspectiva del estudio de las funciones de los monocitos, sus subpoblaciones y otras células inmunes, la presencia de endotoxinas e incluso su presencia enmascarada en EV es de gran importancia12. La contaminación pasada por alto de los vehículos eléctricos con endotoxinas puede llevar a conclusiones engañosas y ocultar su verdadera actividad biológica. En otras palabras, trabajar con células monocíticas requiere confianza en ausencia de contaminación por endotoxinas13. Las fuentes potenciales de endotoxinas pueden ser agua, medios y sueros obtenidos comercialmente, componentes y aditivos de medios, cristalería de laboratorio y artículos de plástico 5,14,15.

Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo para el aislamiento de EV con bajo contenido de endotoxinas. El protocolo proporciona consejos simples sobre cómo evitar la contaminación por endotoxinas durante el aislamiento de EV en lugar de eliminar las endotoxinas de EV. Anteriormente, se han presentado muchos protocolos sobre cómo eliminar endotoxinas de, por ejemplo, nanopartículas diseñadas utilizadas en nanomedicina; sin embargo, ninguno de ellos es útil para estructuras biológicas como los EV. La despirogenación efectiva de nanopartículas puede llevarse a cabo mediante enjuague con etanol o ácido acético, calentamiento a 175 °C durante 3 h, irradiación γ o tratamiento con tritón X-100; sin embargo, estos procedimientos conducen a la destrucción de los vehículos eléctricos16,17.

El protocolo presentado es un estudio pionero centrado en evitar las impurezas de endotoxinas en las EV, a diferencia de estudios previos sobre el efecto de las EV en los monocitos9. La aplicación de los principios propuestos a la práctica de laboratorio puede ayudar a obtener resultados de investigación confiables, lo que puede ser crucial cuando se considera el uso potencial de EV como agentes terapéuticos en la clínica12.

Protocol

1. Preparación de tubos de ultracentrífuga Use tubos estériles de un solo uso. Si esto no es posible, reutilice los tubos de ultracentrífuga después de lavarlos con un detergente utilizando una pipeta estéril Pasteur u otros aplicadores de un solo uso. Recuerde que los tubos de ultracentrífuga deben dedicarse a un tipo de material centrifugado (sobrenadante de cultivo celular / suero / plasma) y especies (humano / ratón / etc.). Después de un lavado con detergente, enjuague l…

Representative Results

Un requisito previo o paso obligatorio para este protocolo es la exclusión de la posible contaminación por endotoxinas de los reactivos. Todos los reactivos utilizados, como FBS, DMEM, RPMI, PBS e incluso tubos de ultracentrífuga, deben estar libres de endotoxinas (<0.005 EU/mL). Mantener el régimen de no contaminación por endotoxinas no es fácil ya que, por ejemplo, el suero regular/estándar para cultivo celular puede ser su fuente rica (0,364 EU/ml; ver Tabla 1). Aunq…

Discussion

En los últimos años, los métodos para el aislamiento adecuado de los vehículos eléctricos se han vuelto cada vez más importantes, lo que permite sus análisis más confiables, por ejemplo, en el contexto de la obtención de datos ómicos y funcionales confiables24. Con base en la experiencia de investigación previa, parece que no solo el tipo de método de aislamiento, sino también otras condiciones durante este procedimiento pueden ser importantes. El uso de FBS sin EV es ampliamente reco…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias, Polonia, número de subvención 2019/33 / B / NZ5 / 00647. Nos gustaría agradecer al profesor Tomasz Gosiewski y Agnieszka Krawczyk del Departamento de Microbiología Médica Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Jagiellonian por su inestimable ayuda en la detección de ADN bacteriano en EV.

Materials

 Alix (3A9) Mouse mAb  Cell Signaling Technology 2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic GoogLab Scientific GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow Cytometr BD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II BD Biosciences 551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13174
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad Laboratories, Inc.  17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)  Corning 10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate Reader BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin  Biowest  S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL  PAN – Biotech P06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005
Immun-Blot PVDF Membrane Bio-Rad Laboratories, Inc.  1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)  Enzo Life Sciences, Inc. ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, Inc.  1703930
Nanoparticle Tracking Analysis  Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)  Invitrogen  NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)  Invitrogen NP0004
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder EURx E3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific A39552
PP Oak Ridge Tube with sealing caps Thermo Scientific 3929, 03613
RPMI 1640 RPMI-1640 (Gibco) 11875093
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystem A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor Thermo Scientific 75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio-Rad Laboratories, Inc.  1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
SW480 cell line American Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell line American Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 um TPP 99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, Inc.  1703940 Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mL SARSTEDT 86.1171.001

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Cite This Article
Babula, A., Siemińska, I., Baj-Krzyworzeka, M. Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (192), e65062, doi:10.3791/65062 (2023).

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