सेल कल्चर के लिए भ्रूण माउस कंकाल की मांसपेशी से 3 डी डीसेल्युलराइज्ड मैट्रिसेस की तैयारी
Summary
इस काम में, भ्रूण माउस कंकाल की मांसपेशी के डीसेलुलराइज्ड मैट्रिसेस प्राप्त करने के लिए एक डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट ्स इन मैट्रिक्स को उपनिवेशित कर सकते हैं, प्रसार कर सकते हैं और अंतर कर सकते हैं। इस इन विट्रो मॉडल का उपयोग कंकाल की मांसपेशियों की बीमारियों जैसे मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी के संदर्भ में सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोशिकाओं के लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करने और संकेतों को व्यक्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं। दो-आयामी (2 डी) सेल कल्चर मॉडल कोशिकाओं और ईसीएम के बीच जटिल बातचीत को अधिक सरल बनाते हैं, क्योंकि पूर्ण त्रि-आयामी (3 डी) समर्थन की कमी सेल व्यवहार को बदल सकती है, जिससे उन्हें विवो प्रक्रियाओं में समझने के लिए अपर्याप्त बना दिया जाता है। ईसीएम संरचना और सेल-ईसीएम इंटरैक्शन में कमी विभिन्न बीमारियों की एक किस्म के लिए महत्वपूर्ण योगदानकर्ता हैं।
एक उदाहरण एलएएमए 2-जन्मजात मांसपेशियों की डिस्ट्रॉफी (एलएएमए 2-सीएमडी) है, जहां कार्यात्मक लैमिनिन 211 और 221 की अनुपस्थिति या कमी से गंभीर हाइपोटनी हो सकती है, जो जन्म के समय या उसके तुरंत बाद पता लगाया जा सकता है। रोग के माउस मॉडल का उपयोग करके पिछले काम से पता चलता है कि इसकी शुरुआत भ्रूण मायोजेनेसिस के दौरान होती है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक 3 डी इन विट्रो मॉडल विकसित करना है जो मांसपेशियों की कोशिकाओं और भ्रूण की मांसपेशी ईसीएम के बीच बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है, जो देशी माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करता है। यह प्रोटोकॉल ई 18.5 माउस भ्रूण से विच्छेदित गहरी पीठ की मांसपेशियों का उपयोग करता है, एक हाइपोटोनिक बफर, एक आयनिक डिटर्जेंट और डीनेस के साथ इलाज किया जाता है। परिणामी डीसेल्युलराइज्ड मैट्रिसेस (डीईसीएम) ने देशी ऊतक की तुलना में परीक्षण किए गए सभी ईसीएम प्रोटीन (लैमिनिन ए 2, कुल लैमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन I और कोलेजन IV) को बरकरार रखा।
जब सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स को इन डीईसीएम के शीर्ष पर बीज दिया गया था, तो उन्होंने डीईसीएम में प्रवेश किया और उपनिवेश किया, जिसने उनके प्रसार और भेदभाव का समर्थन किया। इसके अलावा, सी 2 सी 12 कोशिकाओं ने ईसीएम प्रोटीन का उत्पादन किया, जो डीईसीएम के भीतर उनके आला के रीमॉडेलिंग में योगदान देता है। इस इन विट्रो प्लेटफॉर्म की स्थापना एलएएमए 2-सीएमडी की शुरुआत में शामिल प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए एक नया आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करती है, और इसमें अन्य कंकाल की मांसपेशियों की बीमारियों के लिए अनुकूलित होने की क्षमता है जहां ईसीएम और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के बीच संचार में कमी रोग की प्रगति में योगदान करती है।
Introduction
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) ऊतकों का एक प्रमुख घटक है, जो उनके गैर-सेलुलर घटक का प्रतिनिधित्व करता है। यह त्रि-आयामी (3 डी) संरचना न केवल कोशिकाओं के लिए भौतिक समर्थन प्रदान करती है, बल्कि जीवों के विकास में शामिल जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में भी महत्वपूर्ण भूमिकानिभाती है। ऊतक-विशिष्ट ईसीएम का गठन विकास के दौरान होता है, जो कोशिकाओं और उनके niches के बीच जटिल बातचीत के परिणामस्वरूप होता है, जो विभिन्न इंट्रा- और बाह्य उत्तेजनाओं से प्रभावित होता है। ईसीएम एक अत्यधिक गतिशील संरचना है जो अस्थायी-स्थानिक तरीके से रासायनिक और यांत्रिक पुनर्व्यवस्था से गुजरती है और सीधे सेल भाग्य2 को प्रभावित करती है। ईसीएम की सबसे उल्लेखनीय विशेषताओं में से एक इसकी कार्यात्मक विविधता है, क्योंकि प्रत्येक ऊतक ईसीएम अणुओं का एक अनूठा संयोजन प्रदर्शित करता है जो विभिन्न टोपोलॉजी और गुण प्रदान करते हैं जोइसमें मौजूद कोशिकाओं के अनुरूप होते हैं।
ईसीएम सिग्नलिंग और समर्थन विकास और होमियोस्टैसिस के लिए महत्वपूर्ण हैं, और जब बाधित होता है तो कई रोग संबंधी स्थितियां हो सकती हैं 3,4. एक उदाहरण एलएएमए 2-कमी जन्मजात डिस्ट्रॉफी (एलएएमए 2-सीएमडी) है, जो जन्मजात मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी का सबसे आम रूप है। एलएएमए 2 जीन लैमिनिन ए 2 श्रृंखला के लिए एन्कोड करता है, जो लैमिनिन 211 और लैमिनिन 221 में मौजूद है, और जब उत्परिवर्तित होता है तो एलएएमए 2-सीएमडी 5 हो सकता है। लैमिनिन 211 कंकाल की मांसपेशी फाइबर के आसपास तहखाने की झिल्ली में पाया जाने वाला मुख्य आइसोफॉर्म है। जब लैमिनिन 211 असामान्य या अनुपस्थित होता है, तो तहखाने की झिल्ली और मांसपेशियों की कोशिकाओं के बीच की कड़ी बाधित हो जाती है, जिससे रोगकी शुरुआत होती है। एलएएमए 2-सीएमडी वाले रोगी एलएएमए 2 जीन में उत्परिवर्तन के प्रकार के आधार पर हल्के से गंभीर फेनोटाइप दिखाते हैं।
जब लेमिनिन ए 2 प्रोटीन का कार्य प्रभावित होता है, तो रोगी जन्म के समय गंभीर मांसपेशी हाइपोटोनिया का अनुभव कर सकते हैं और पुरानी सूजन, फाइब्रोसिस और मांसपेशी शोष विकसित कर सकते हैं, जिससे जीवन प्रत्याशा कम हो जाती है। आज तक, कोई लक्षित उपचार विकसित नहीं किया गया है और चिकित्सीयदृष्टिकोण रोग के लक्षणों को कम करने तक सीमित हैं। इसलिए, इस बीमारी की शुरुआत में शामिल अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझना उचितचिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एलएएमए 2-सीएमडी के लिए एक मॉडल डीवाईडब्ल्यू माउस9 का उपयोग करने वाले पिछले काम से पता चलता है कि बीमारी की शुरुआत गर्भाशय में शुरू होती है, विशेष रूप से भ्रूण मायोजेनेसिस10 के दौरान। भ्रूण मायोजेनेसिस दोष कैसे उभरता है, इसकी बेहतर समझ एलएएमए 2-सीएमडी के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोण पैदा करने में एक गेम चेंजर होगी।
इन विट्रो सिस्टम सेल-सेल और सेल-ईसीएम इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करते हैं, लेकिन 2 डी कल्चर मॉडल में देशी ऊतकों की जटिलता की कमी होती है। ऊतकों का विकोशिकीयकरण ऊतक- और विकासात्मक चरण-विशिष्ट एककोशिकीय ईसीएम मचानों का उत्पादन करता है जो 2 डी मॉडल और इंजीनियर / सिंथेटिक मचानों की तुलना में प्राकृतिक सेल माइक्रोएन्वायरमेंट की अधिक सटीक नकल करते हैं। डीसेल्युलराइज्ड मैट्रिसेस (डीईसीएम) में मेजबान ऊतक के आणविक और यांत्रिक संकेतों को संरक्षित करने की क्षमता होती है, जिससे उन्हें विवो प्रक्रियाओं में समझने के लिए बेहतर वैकल्पिक मॉडल मिलते हैं।
विभिन्न तकनीकें, अभिकर्मक और स्थितियां हैं जिनका उपयोग विकोशिकीयकरण12,13 के लिए किया जा सकता है। इस अध्ययन में, सिल्वा एट अल .14,15 द्वारा वर्णित भ्रूण माउस दिल के लिए एक डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल, भ्रूण माउस कंकाल की मांसपेशियों के लिए अनुकूलित किया जाता है और सभी परीक्षण किए गए ईसीएम घटकों (लैमिनिन ए 2, कुल लैमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन I और कोलेजन IV) को बनाए रखने के लिए पाया जाता है। प्रोटोकॉल में तीन चरण शामिल हैं: आसमाटिक शॉक (हाइपोटोनिक बफर), प्लाज्मा झिल्ली विघटन और प्रोटीन पृथक्करण (0.05% सोडियम डोडेसिल सल्फेट [एसडीएस]), और डीएनए के एंजाइमेटिक विनाश (डीनेस उपचार)। हमारे ज्ञान के लिए, यह माउस भ्रूण कंकाल की मांसपेशियों को डीसेल्युलर करने के लिए पहला स्थापित प्रोटोकॉल है।
एलएएमए 2-सीएमडी का अध्ययन करने के लिए इस 3 डी इन विट्रो सिस्टम का उपयोग करने के लिए, डीसेलुलराइजेशन के बाद लैमिनिन ए 2 श्रृंखला को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इसलिए, एक अनुकूलन प्रोटोकॉल लागू किया गया था जहां विभिन्न डिटर्जेंट (एसडीएस और ट्राइटन एक्स -100) और सांद्रता (0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, और 0.5%) का परीक्षण किया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया था)। लेमिनिन ए 2 प्रोटीन के सेल हटाने और संरक्षण के लिए इष्टतम विकल्प 0.05% एसडीएस पाया गया था। सी 2 सी 12 कोशिकाएं, एक अच्छी तरह से स्थापित मायोब्लास्ट सेल लाइन16,17, का उपयोग डीईसीएम को बीज देने के लिए किया गया था। ये कोशिकाएं डीईसीएम पर आक्रमण करती हैं, प्रसार करती हैं, और इन मचानों के अंदर अंतर करती हैं, नए ईसीएम प्रोटीन को संश्लेषित करती हैं। इस 3 डी इन विट्रो मॉडल का सफल उत्पादन भ्रूण के मायोजेनेसिस में शामिल आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है, एलएएमए 2-सीएमडी की शुरुआत, और इसे अन्य मांसपेशियों की बीमारियों तक बढ़ाया जा सकता है जहां ईसीएम और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के बीच संचार बाधित होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ईसीएम मैक्रोमोलेक्यूल्स का एक जटिल नेटवर्क है जो सभी ऊतकों में मौजूद है और सेल व्यवहार और फ़ंक्शन2 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। ईसीएम कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए एक भ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एसोसिएशन फ्रैंकाइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथिस (एएफएम-टेलेथॉन; अनुबंध संख्या 23049), मैट्रिहेल्थ प्रोजेक्ट और सीई 3 सी यूनिट फंडिंग यूआईडीबी / 00329/2020 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम अपने दाता हेनरिक मीरेल्स को धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने मैट्रिहेल्थ प्रोजेक्ट का समर्थन करना चुना। इस काम को विज्ञान माइक्रोस्कोपी सुविधा के संकाय के बुनियादी ढांचे से लाभ हुआ, जो बायोइमेजिंग के पुर्तगाली प्लेटफॉर्म (संदर्भ पीपीबीआई-पीओसीआई-01-0145-फेडर-022122) का एक नोड है, और हम छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण के साथ उनकी सहायता के लिए लुइस मार्कस को धन्यवाद देते हैं। अंत में, हम तकनीकी सहायता के लिए मार्टा पाल्मा और उनके उदार योगदान के लिए हमारी शोध टीम को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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