Summary

Fremstilling af 3D decellulariserede matricer fra føtal mus skeletmuskulatur til cellekultur

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

I dette arbejde blev en decellulariseringsprotokol optimeret til at opnå decellulariserede matricer af føtal museskeletmuskulatur. C2C12 myoblaster kan kolonisere disse matricer, sprede sig og differentiere. Denne in vitro-model kan bruges til at studere celleadfærd i forbindelse med skeletmuskelsygdomme såsom muskeldystrofier.

Abstract

Den ekstracellulære matrix (ECM) spiller en afgørende rolle i at yde strukturel støtte til celler og formidle signaler, der er vigtige for forskellige cellulære processer. Todimensionelle (2D) cellekulturmodeller oversimplificerer de komplekse interaktioner mellem celler og ECM, da manglen på en komplet tredimensionel (3D) støtte kan ændre celleadfærd, hvilket gør dem utilstrækkelige til forståelse in vivo-processer . Mangler i ECM-sammensætning og celle-ECM-interaktioner er vigtige bidragydere til en række forskellige sygdomme.

Et eksempel er LAMA2-medfødt muskeldystrofi (LAMA2-CMD), hvor fravær eller reduktion af funktionel laminin 211 og 221 kan føre til alvorlig hypotoni, påviselig ved eller kort efter fødslen. Tidligere arbejde ved hjælp af en musemodel af sygdommen tyder på, at dens begyndelse forekommer under føtal myogenese. Denne undersøgelse havde til formål at udvikle en 3D in vitro-model , der gjorde det muligt at studere interaktionerne mellem muskelceller og føtal muskel-ECM, der efterligner det oprindelige mikromiljø. Denne protokol bruger dybe rygmuskler dissekeret fra E18.5 musefostre, behandlet med en hypotonisk buffer, et anionisk rengøringsmiddel og DNase. De resulterende decellulariserede matricer (dECM’er) bevarede alle testede ECM-proteiner (laminin α2, samlede lamininer, fibronectin, kollagen I og kollagen IV) sammenlignet med det oprindelige væv.

Når C2C12 myoblaster blev podet oven på disse dECM’er, trængte de ind og koloniserede dECM’erne, hvilket understøttede deres spredning og differentiering. Desuden producerede C2C12-cellerne ECM-proteiner, hvilket bidrog til ombygningen af deres niche inden for dECM’erne. Etableringen af denne in vitro-platform giver en ny lovende tilgang til at optrævle de processer, der er involveret i begyndelsen af LAMA2-CMD, og har potentiale til at blive tilpasset andre skeletmuskelsygdomme, hvor mangler i kommunikationen mellem ECM og skeletmuskelceller bidrager til sygdomsprogression.

Introduction

Den ekstracellulære matrix (ECM) er en vigtig bestanddel af væv, der repræsenterer deres ikke-cellulære komponent. Denne tredimensionelle (3D) struktur giver ikke kun fysisk støtte til celler, men spiller også en afgørende rolle i de biokemiske processer, der er involveret i udviklingen af organismer1. Dannelsen af en vævsspecifik ECM forekommer under udvikling som et resultat af de komplekse interaktioner mellem celler og deres nicher, påvirket af forskellige intra- og ekstracellulære stimuli. ECM er en meget dynamisk struktur, der gennemgår kemiske og mekaniske omlejringer på en tidsmæssig-rumlig måde og direkte påvirker celleskæbne2. Et af de mest bemærkelsesværdige kendetegn ved ECM er dets funktionelle mangfoldighed, da hver vævs-ECM viser en unik kombination af molekyler, der giver forskellige topologier og egenskaber, der er skræddersyet til de celler, den indeholder1.

ECM-signalering og støtte er afgørende for udvikling og homeostase, og når de forstyrres, kan det føre til flere patologiske tilstande 3,4. Et eksempel er LAMA2-mangelfuld medfødt dystrofi (LAMA2-CMD), som er den mest almindelige form for medfødt muskelsvind. LAMA2-genet koder for laminin α2-kæden, som er til stede i laminin 211 og laminin 221, og når det muteres, kan det føre til LAMA2-CMD5. Laminin 211 er den vigtigste isoform, der findes i kældermembranen, der omgiver skeletmuskelfibre. Når laminin 211 er unormal eller fraværende, forstyrres forbindelsen mellem kældermembranen og muskelcellerne, hvilket fører til sygdommens begyndelse6. Patienter med LAMA2-CMD viser en mild til svær fænotype afhængigt af typen af mutation i LAMA2-genet.

Når funktionen af laminin α2-proteinet påvirkes, kan patienterne opleve alvorlig muskelhypotoni ved fødslen og udvikle kronisk inflammation, fibrose og muskelatrofi, hvilket fører til en reduceret forventet levetid. Til dato er der ikke udviklet målrettede behandlinger, og terapeutiske tilgange er begrænset til at lindre symptomerne på sygdommen7. Derfor er forståelse af de underliggende molekylære mekanismer, der er involveret i begyndelsen af denne sygdom, afgørende for at udvikle passende terapeutiske strategier 6,8. Tidligere arbejde ved hjælp af dyW-musen 9, en model for LAMA2-CMD, tyder på, at sygdommens begyndelse starter i utero, specifikt under føtal myogenese10. En bedre forståelse af, hvordan fostrets myogenesedefekt opstår, ville være en spilskifter i generering af nye terapeutiske tilgange til LAMA2-CMD.

In vitro-systemer giver et kontrolleret miljø til undersøgelse af celle-celle- og celle-ECM-interaktioner, men 2D-kulturmodeller mangler kompleksiteten af indfødte væv. Decellularisering af væv producerer vævs- og udviklingsfasespecifikke acellulære ECM-stilladser, der mere præcist efterligner det naturlige cellemikromiljø sammenlignet med 2D-modeller og konstruerede / syntetiske stilladser. Decellulariserede matricer (dECM’er) har potentialet til at bevare værtsvævets molekylære og mekaniske signaler, hvilket gør dem til bedre alternative modeller til forståelse af in vivo-processer 11.

Der er forskellige teknikker, reagenser og betingelser, der kan bruges til decellularisering12,13. I denne undersøgelse er en decellulariseringsprotokol for føtal musehjerte, beskrevet af Silva et al.14,15, tilpasset føtal museskeletmuskulatur og fundet at bevare alle testede ECM-komponenter (laminin α2, total lamininer, fibronectin, kollagen I og kollagen IV). Protokollen omfatter tre trin: cellelyse ved osmotisk shock (hypotonisk buffer), plasmamembranopløsning og proteindissociation (0,05% natriumdodecylsulfat [SDS]) og enzymatisk ødelæggelse af DNA (DNase-behandling). Så vidt vi ved, er dette den første etablerede protokol til decellularisering af museføtal skeletmuskulatur.

For at bruge dette 3D in vitro-system til undersøgelse af LAMA2-CMD er det afgørende at opretholde laminin α2-kæden efter decellularisering. Derfor blev der implementeret en optimeringsprotokol, hvor forskellige vaskemidler (SDS og Triton X-100) og koncentrationer (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% og 0,5%) blev testet (data ikke vist). Det optimale valg til cellefjernelse og konservering af laminin α2-proteinet viste sig at være 0,05% SDS. C2C12-celler, en veletableret myoblastcellelinje16,17, blev brugt til at frø dECM’erne. Disse celler invaderer dECM, formerer sig og differentierer sig inde i disse stilladser og syntetiserer nye ECM-proteiner. Den vellykkede produktion af denne 3D in vitro-model tilbyder en ny tilgang til forståelse af de molekylære og cellulære processer, der er involveret i føtal myogenese, begyndelsen af LAMA2-CMD, og kan udvides til andre muskelsygdomme, hvor kommunikationen mellem ECM og skeletmuskelceller forstyrres.

Protocol

Alle de beskrevne metoder blev godkendt af dyrevelfærdsudvalget (ORBEA) ved Det Naturvidenskabelige Fakultet, Lissabon Universitet og Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022) og er i overensstemmelse med det europæiske direktiv 2010/63/EU. 1. Fremstilling af decellulariseringsbuffere og reagenser BEMÆRK: Alle opløsninger, der anvendes under decellulariseringsprotokollen, skal steriliseres ved autoklavering og opbevares i op t…

Representative Results

Målet med decellulariseringsprotokollen er at producere dECM’er, der ligner sammensætningen af naturligt væv. For at bestemme effektiviteten af decellulariseringsprocessen blev der anvendt forskellige metoder, herunder undersøgelse af vævsmorfologi, måling af DNA-niveauer, farvning for F-actin og analyse af centrale ECM-komponenter ved hjælp af immunhistokemi og western blotting-teknikker. Specifikt blev fem store ECM-komponenter i skeletmuskelvæv analyseret. I hele protokollen ændres…

Discussion

ECM er et komplekst netværk af makromolekyler, der er til stede i alle væv og spiller en afgørende rolle i reguleringen af celleadfærd og funktion2. ECM fungerer som et fysisk stillads, som celler kan fastgøres til og giver signaler, der aktivt modulerer cellulære processer såsom spredning, motilitet, differentiering og apoptose. Således er korrekt dannelse og vedligeholdelse af ECM afgørende for både udvikling og homeostase1.

Mens 2D-c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; kontrakt nr. 23049), MATRIHEALTH-projektet og cE3c-enhedsfinansiering UIDB/00329/2020. Vi vil gerne takke vores donor Henrique Meirelles, der valgte at støtte MATRIHEALTH-projektet. Dette arbejde nød godt af infrastrukturerne i Det Naturvidenskabelige Fakultets mikroskopifacilitet, en knude i den portugisiske platform for bioimaging (reference PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), og vi takker Luís Marques for hans hjælp med billedoptagelse og -behandling. Endelig takker vi Marta Palma for teknisk support og vores forskerteam for deres generøse bidrag.

Materials

12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Merck D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21024
Bovine Serum Albumin, Fraction V NZYtech MB04601
BX60 fluorescence microscope Olympus
Cryostat CM1860 UV Leica
Dithiothreitol ThermoFisher R0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate Biowest L0103-500
DNase I PanReac AppliChem A3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck 108418
Fetal bovine serum Biowest S1560-500
Fine tip transfer pipette ThermoFisher 15387823
Goat serum Biowest S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubator Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard Invitrogen
Horse Serum, New Zealand origin Gibco 16050122
HRP-α- Rabbit IgG abcam ab205718
HRP-α- Rat IgG abcam ab205720
HRP-α-Mouse IgG abcam ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green Sigma-Aldrich 67060
MM400 Tissue Lyser Retsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSP GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci. A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) Greiner Bio-One 628161
Qubit dsDNA HS kit Thermo Scientific Q32851
Qubit™ 3 Fluorometer Invitrogen 15387293
S6E Zoom Stereo microscope Leica
Sodium Dodecyl Sulfate Merck 11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slides Thermo Scientific 631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 15626144
TCS SPE confocal microscope Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% VWR Chemicals 28811.295
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) GRiSP GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution) ThermoFisher 3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) Advansta L-08024-001
α-Collagen I abcam ab21286
α-Collagen IV Millipore AB756P
α-Collagen IV Santa Cruz Biotechnology sc-398655
α-Fibronectin Sigma F-3648
α-Laminin α2 Sigma L-0663
α-MHC D.S.H.B. MF20
α-Mouse Alexa 488 Molecular Probes A11017
α-Mouse Alexa 568 Molecular Probes A11019
α-pan-Laminin Sigma L- 9393
α-phospho-histone 3 Merk Millipore 06-570
α-Rabbit Alexa 568 Molecular Probes A21069
α-Rabbit Alexa 488 Molecular Probes A11070
α-Rat Alexa 488 Molecular Probes A11006

References

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Play Video

Cite This Article
Gameiro dos Santos, P., Soares, A. R., Thorsteinsdóttir, S., Rodrigues, G. Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture. J. Vis. Exp. (193), e65069, doi:10.3791/65069 (2023).

View Video