Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino
Summary
I cavalli hanno un’eccezionale capacità di esercizio aerobico, rendendo il muscolo scheletrico equino un tessuto importante sia per lo studio della fisiologia dell’esercizio equino che per la fisiologia mitocondriale dei mammiferi. Questo articolo descrive le tecniche per la valutazione completa della funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.
Abstract
La funzione mitocondriale – fosforilazione ossidativa e generazione di specie reattive dell’ossigeno – è fondamentale sia per la salute che per la malattia. Pertanto, misurare la funzione mitocondriale è fondamentale nella ricerca biomedica. Il muscolo scheletrico è una robusta fonte di mitocondri, in particolare negli animali con una capacità aerobica molto elevata, come i cavalli, rendendoli soggetti ideali per lo studio della fisiologia mitocondriale. Questo articolo dimostra l’uso della respirometria ad alta risoluzione con fluorometria concomitante, con mitocondri muscolari scheletrici appena raccolti, per quantificare la capacità di ossidare i substrati in diversi stati mitocondriali e determinare le capacità relative di elementi distinti della respirazione mitocondriale. L’estere metilestrale tetrametilrodamina viene utilizzato per dimostrare la produzione di potenziale di membrana mitocondriale derivante dall’ossidazione del substrato, compreso il calcolo dell’efficienza relativa dei mitocondri calcolando il potenziale di membrana relativo generato per unità di flusso concomitante di ossigeno. La conversione di ADP in ATP provoca un cambiamento nella concentrazione di magnesio nella camera di reazione, a causa delle diverse affinità degli adenilati per il magnesio. Pertanto, il verde magnesio può essere utilizzato per misurare la velocità di sintesi dell’ATP, consentendo l’ulteriore calcolo dell’efficienza di fosforilazione ossidativa (rapporto tra fosforilazione e ossidazione [P/O]). Infine, l’uso di Amplex UltraRed, che produce un prodotto fluorescente (resorufin) quando combinato con perossido di idrogeno, consente la quantificazione della produzione di specie reattive dell’ossigeno durante la respirazione mitocondriale, nonché la relazione tra produzione di ROS e respirazione concomitante. Queste tecniche consentono la robusta quantificazione della fisiologia mitocondriale in una varietà di diverse condizioni simulate, facendo così luce sul contributo di questa componente cellulare critica sia alla salute che alla malattia.
Introduction
I mitocondri delle cellule eucariotiche producono la maggior parte dell’ATP utilizzato dalle cellule per il lavoro e il mantenimento1. Un passo chiave nella produzione mitocondriale di ATP è la conversione dell’ossigeno in acqua, e quindi la capacità metabolica dei mitocondri e delle cellule associate è spesso quantificata attraverso la misurazione del consumo di ossigeno2. Tuttavia, la fisiologia mitocondriale è più complessa del semplice processo di consumo di ossigeno e la dipendenza da questo endpoint fornisce esclusivamente una valutazione incompleta dell’impatto della funzione e della disfunzione mitocondriale sulla salute cellulare. La caratterizzazione completa della funzione mitocondriale richiede la valutazione non solo del consumo di ossigeno, ma anche della produzione di ATP e delle specie reattive dell’ossigeno (ROS).
Ulteriori misure delle funzioni mitocondriali chiave possono essere eseguite in concomitanza con la misurazione della respirazione attraverso l’uso di fluorofori specifici. Il tetrametilrodamina metilestere (TMRM) è un fluoroforo cationico che si accumula nella matrice mitocondriale in proporzione al potenziale di tensione transmembrana mitocondriale, con conseguente diminuzione dell’intensità fluorescente dovuta a questo accumulo3. La TMRM può essere utilizzata come indicatore dei cambiamenti relativi nel potenziale di membrana mitocondriale o può essere utilizzata per quantificare cambiamenti precisi nella tensione transmembrana con ulteriori esperimenti per determinare costanti che consentano la conversione del segnale fluorescente in mV. Il verde di magnesio (MgG) è un fluoroforo che fluoresce quando si lega con Mg2+ e viene utilizzato per misurazioni della sintesi di ATP basate sull’affinità differenziale di ADP e ATP per il catione bivalente di magnesio4. I ricercatori devono determinare le costanti di affinità/dissociazione specifiche (Kd) sia per ADP che per ATP in specifiche condizioni analitiche per convertire le variazioni della fluorescenza di MgG in una variazione della concentrazione di ATP. Amplex UltraRed (AmR) è il fluoroforo utilizzato per misurare la produzione di perossido di idrogeno e altri ROS durante la respirazione mitocondriale5. La reazione tra H2 O2 e AmR (che è catalizzata dalla perossidasi di rafano) produce resorufina, che è rilevabile attraverso la fluorescenza a 530 nM. Ciascuno di questi test può essere aggiunto individualmente ai saggi di respirazione mitocondriale in tempo reale, per fornire misurazioni simultanee dei rispettivi aspetti della fisiologia mitocondriale, fornendo così un collegamento diretto tra respirazione e output mitocondriale.
I cavalli sono capaci di tassi molto elevati di consumo di ossigeno specifico per massa, dovuto in parte all’altissimo contenuto mitocondriale del muscolo scheletrico equino, rendendo questo tessuto altamente rilevante per lo studio della fisiologia mitocondriale. Con lo sviluppo della respirometria ad alta risoluzione, gli studi che utilizzano questa nuova tecnologia hanno contribuito a definire i contributi dei mitocondri del muscolo scheletrico equino sia alla notevole capacità di esercizio dei cavalli che alla fisiopatologia delle malattie del muscolo scheletrico 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Gli studi sulla funzione mitocondriale del muscolo scheletrico equino sono particolarmente vantaggiosi, in quanto l’ottenimento di grandi quantità di questo tessuto non è terminale. Pertanto, i soggetti equini possono non solo fornire tessuto sufficiente per la caratterizzazione completa della funzione mitocondriale, ma anche servire come controlli longitudinali per studi meccanicistici di alta qualità sulla fisiologia mitocondriale. Per questo motivo, sono stati sviluppati ulteriori saggi per quantificare il potenziale di membrana mitocondriale, la sintesi di ATP e la produzione di ROS che completano la misurazione del consumo di ossigeno in questo tessuto, al fine di fornire una caratterizzazione più robusta della fisiologia mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’aggiunta di segnali fluorescenti all’uscita standard del respirometro ad alta risoluzione fornisce preziose informazioni sulla fisiologia mitocondriale, ma una calibrazione meticolosa del segnale fluorescente è fondamentale per i dati di qualità. I protocolli originali per l’uso di MgG suggeriscono che le curve di calibrazione generate durante il calcolo delle costanti di dissociazione magnesio-adenilato potrebbero essere applicate ai saggi successivi4; tuttavia, il segnale fluorescente proven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il generoso sostegno della John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine e della Grayson Jockey Club Research Foundation.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
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