यह लेख एक बेंचटॉप 3 डी निलंबन बायोरिएक्टर में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचआईपीएससी) से न्यूरोनल वंश कोशिकाओं की व्युत्पत्ति ने मस्तिष्क अनुसंधान में एक मील का पत्थर चिह्नित किया। उनके पहले आगमन के बाद से, प्रोटोकॉल को लगातार अनुकूलित किया गया है और अब अनुसंधान और दवा विकास में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन पारंपरिक भेदभाव और परिपक्वता प्रोटोकॉल की बहुत लंबी अवधि और उच्च गुणवत्ता वाले HIPSC और उनके तंत्रिका डेरिवेटिव की बढ़ती मांग बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए इन प्रोटोकॉल को अपनाने, अनुकूलन और मानकीकरण की आवश्यकता को बढ़ाती है। यह काम आनुवंशिक रूप से संशोधित, डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल न्यूरोजेनिन 2 (आईएनजीएन 2) के भेदभाव के लिए एक तेज और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है – एक बेंचटॉप त्रि-आयामी (3 डी) निलंबन बायोरिएक्टर का उपयोग करके न्यूरॉन्स में एचआईपीएससी व्यक्त करता है।
संक्षेप में, iNGN2-HIPSC के एकल-कोशिका निलंबन को 24 घंटे के भीतर समुच्चय बनाने की अनुमति दी गई थी, और न्यूरोनल वंश प्रतिबद्धता को डॉक्सीसाइक्लिन के अतिरिक्त प्रेरित किया गया था। प्रेरण के 2 दिनों के बाद समुच्चय को अलग कर दिया गया था और कोशिकाओं को टर्मिनल परिपक्वता के लिए या तो क्रायोसंरक्षित या फिर से चढ़ाया गया था। उत्पन्न आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स ने शास्त्रीय न्यूरोनल मार्करों को जल्दी व्यक्त किया और रीप्लेटिंग के बाद 1 सप्ताह के भीतर जटिल न्यूरिटिक नेटवर्क का गठन किया, जो न्यूरोनल संस्कृतियों की बढ़ती परिपक्वता का संकेत देता है। सारांश में, 3 डी वातावरण में एचआईपीएस-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की तेजी से पीढ़ी के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है जो रोग मॉडलिंग, फेनोटाइपिक उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और बड़े पैमाने पर विषाक्तता परीक्षण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में बड़ी क्षमता रखता है।
न्यूरोलॉजिकलविकार दुनिया भर में विकलांगता का प्रमुख कारण हैं। छह में से एक व्यक्ति प्रभावित होता है, और घटना बढ़ती जा रही है। समाजों और उनकी स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों पर संबंधित वित्तीय बोझ बहुत बड़ा है। 2010 में 30 यूरोपीय देशों के मूल्यांकन ने मानसिक औरन्यूरोलॉजिकल विकारों से संबंधित € 800 बिलियन की वार्षिक लागत का अनुमान लगाया। बढ़ते सामाजिक आर्थिक बोझ प्रभावी उपचार रणनीतियों की मांग करते हैं, और हालांकि रोग पैथोफिज़ियोलॉजी की हमारी समझ में काफी वृद्धि हुई है, क्लीनिकों में अनुवाद अक्सर अपर्याप्त होता है। सामान्य तौर पर, केवल 12% फार्मास्यूटिकल्स नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करते हैं, जिनमें से 80% से अधिक बाद के चरणों के दौरान विफल हो जाते हैं, मुख्य रूप से अक्षमता या अप्रत्याशित विषाक्तताके कारण 3,4। कारण अलग-अलग हैं, लेकिन प्रीक्लिनिकल चरणों में पशु परीक्षण से मानव परीक्षणों तक सीमित हस्तांतरणीयता तेजी से सामने आईहै। मानव इन विट्रो सेल और ऊतक मॉडल अंतर-प्रजाति अनुवाद की खाई को पाट सकते हैं, और मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) प्रौद्योगिकी में प्रगति में इस संबंध में बड़ी क्षमता है। HIPSC का व्यापक रूप से बुनियादी अनुसंधान में उपयोग किया जाता है और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) के साथ आवश्यक विशेषताओं को साझा करता है, जैसे कि लगभग असीमित आत्म-नवीकरण क्षमता और भ्रूण विनाश से जुड़ी नैतिक चिंताओं को दरकिनार करते हुए सभी तीन रोगाणु परतों6 में अंतर करने की क्षमता।
एचईएससी से न्यूरोनल कोशिकाओं की व्युत्पत्ति, और बाद में एचआईपीएससी ने मस्तिष्क अनुसंधान में एक मील का पत्थर चिह्नित किया। प्रारंभिक भेदभाव प्रोटोकॉल भ्रूणजनन के दौरान महत्वपूर्ण चरणों की नकल करने वाले विकास कारकों के अनुप्रयोग पर आधारित थे, उनमें से अधिकांश में दोहरे एसएमएडी निषेध या तो निलंबन याअनुयायी संस्कृतियों 7,8,9 में शामिल थे। परिपक्व न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक उत्पन्न हुए हैं, लेकिन इन प्रोटोकॉल की कई कमियां अभी भी दवा के विकास में उनके व्यापक उपयोग में बाधा डालती हैं, जैसे कि उत्पन्न न्यूरॉन्स की कम उपज और उच्च बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता, साथ ही साथ लंबे संस्कृति समय से संबंधित व्यापक कार्यभार। न्यूरोजेनेसिस में गंभीर रूप से शामिल प्रतिलेखन कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा सुधार हासिल किए गए हैं, और न्यूरोजेनिन (एनजीएन) परिवार के सदस्यों, विशेष रूप से एनजीएन 2, को प्रभावी ड्राइवरोंके रूप में पहचाना गया है। HIPSC में NGN2 की लेंटिवायरल-मध्यस्थता एक्टोपिक अभिव्यक्ति ने न्यूरोनल भेदभाव के शुरुआती चरणों को काफी तेज कर दिया, और केवल 1 सप्ताह11 के भीतर न्यूरोनल सेल भाग्य को प्रेरित किया। एस्ट्रोसाइट्स के साथ सह-संस्कृतियों में बाद में टर्मिनल परिपक्वता ने प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गुणों के साथ उच्च शुद्धता और मात्रा में कार्यात्मक न्यूरॉन्स उत्पन्न किए। एडेनो-संबद्ध वायरस एकीकरण साइट 1 (एएवीएस 1) सुरक्षित-बंदरगाह लोकस के साइट-निर्देशित जीन-संपादन को तब एनजीएन 212,13 के लिए एक स्थिर और डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल अभिव्यक्ति कैसेट के साथ हाईपीएससी लाइनों को बनाने के लिए लागू किया गया था, इस प्रकार लेंटीवायरल डिलीवरी के अवांछित दुष्प्रभावों को कम किया गया था।
डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल न्यूरोजेनिन 2 (आईएनजीएन 2) न्यूरॉन्स का मजबूत और कुशल भेदभाव उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिक दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परख10,14,15 के लिए बहुत क्षमता रखता है; और पिछले दशक के दौरान एक स्केलेबल सेल विस्तार और विभेदन16,17,18,19 के लिए बायोरिएक्टर को लागू करने में बायोप्रोसेसिंग में पर्याप्त प्रगति हुई है। हालांकि, अधिकांश भेदभाव प्रोटोकॉल अनुयायी संस्कृतियों के लिए अनुकूलित हैं, और तीन-आयामी (3 डी) वातावरण में अनुवाद के लिए अक्सर आवश्यक संशोधनों की आवश्यकता होती है। हाल ही में, कम कतरनी तनाव सुविधाओं के साथ एक बेंचटॉप 3 डी बायोरिएक्टर का सफल उपयोग एचपीएससी के विस्तार और हेपेटोसाइट्स, कार्डियोमायोसाइट्स और न्यूरॉन्स20 में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य भेदभाव के लिए रिपोर्ट किया गया है। यहां, समान बेंचटॉप 3 डी बायोरिएक्टर का उपयोग करके आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स की पीढ़ी और लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है।
न्यूरोनल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एनजीएन 2 की एक्टोपिक अभिव्यक्ति को पहले न्यूरोनल भेदभाव के शुरुआती चरणों में तेजी लाने और खेती के 1 सप्ताह के भीतर एचआईपीएससी में न्यूरोनल वंश प्रतिबद्धता को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। यह काम एक बेंचटॉप बायोरिएक्टर का उपयोग करके जीन-संपादित बायोनी010-सी -13 एचआईपीएससी को आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स में भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
सीईआरओ 3 डी बायोरिएक्टर एक कम मात्रा वाला बायोरिएक्टर है जिसमें विशेष ट्यूबों के लिए चार स्लॉट हैं, जिनमें से प्रत्येक की अधिकतम क्षमता 50 एमएल है। तापमान और सीओ2 स्तरों को लगातार नियंत्रित किया जाता है और प्रत्येक ट्यूब के लिए खेती के मापदंडों (जैसे, घूर्णी गति और समय) को विनियमित किया जाता है, जो स्वतंत्र रूप से उपयोगकर्ताओं को समानांतर में कई भेदभाव दृष्टिकोण चलाने में सक्षम बनाता है। आंतरिक ट्यूब की दीवार पर एकीकृत वेवब्रेकर कम कतरनी तनाव के साथ माध्यम के गड़बड़ी की अनुमति देते हैं और नियंत्रित रोटेशन के दौरान निलंबन में 3 डी समुच्चय बनाए रखते हैं। पोषक तत्वों तक सीमित पहुंच, साथ ही लागू 3 डी सेल-सेल और सेल-एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) इंटरैक्शन, सेलुलर भेदभाव और व्यवहार24,25,26,27 को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं।
निलंबन में 3 डी समुच्चय के रूप में कोशिकाओं का संवर्धन इन सेल इंटरैक्शन को बढ़ाता है, जिससे ऊतक या अंगों के विवो वातावरण की अधिक बारीकी से नकल की जाती है। माध्यम का सहवर्ती क्षोभ यांत्रिक घर्षण के कारण कुल आकार को नियंत्रित करता है, गैस विनिमय में सुधार करता है, और ट्यूब में पोषक तत्वों और अपशिष्ट की ढाल को कम करता है, जबकि समुच्चय 29,30,31,32,33,34 के अंदर शारीरिक प्रासंगिक ग्रेडिएंट को संरक्षित करता है।. यद्यपि मध्यम परिवर्तन मैन्युअल रूप से किए जाते हैं, बेंचटॉप बायोरिएक्टर स्थिर संस्कृति फ्लास्क की तुलना में श्रम और परिचालन लागत को कम करता है। बायोरिएक्टर पूरी तरह से स्वचालित स्टर-टैंक बायोरिएक्टर पर कई फायदे भी प्रदान करता है, क्योंकि इम्पेलर मुक्त डिजाइन समग्र सतह पर हाइड्रोडायनामिक कतरनी तनाव को कम करता है, जिससे न केवल सेल अस्तित्व में सुधार होता है, बल्कि संवेदनशील आईपीएससी, सेल भेदभाव और फ़ंक्शन35,36,37,38 पर कतरनी तनाव के प्रभाव को भी सीमित किया जाता है।
ऊर्ध्वाधर पहिया बायोरिएक्टर, जिसमें कोशिकाओं को एक बड़े ऊर्ध्वाधर इम्पेलर द्वारा उत्तेजित किया जाता है, साथ ही मोटर चालित प्लेटफॉर्म से जुड़े फुलाए गए कल्चर बैग का उपयोग करके रॉकिंग मोशन बायोरिएक्टर, वैकल्पिक 3 डी निलंबन प्लेटफार्मों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यद्यपि HIPSC 17,18,19,39,40 की खेती के लिए अत्यधिक परीक्षण किया गया है, न्यूरोनल भेदभाव दृष्टिकोण में उनकी प्रयोज्यता के बारे में बहुत कम जानकारी है, और रिपोर्ट स्टिर-टैंक बायोरिएक्टर 41,42,43,44 में स्तनधारी और मानव तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं के सफल विस्तार तक सीमित हैं, जिसमें दुर्लभ संख्या में अध्ययन ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। परिपक्वता44,45. सामान्य तौर पर, स्वचालित 3 डी निलंबन प्लेटफ़ॉर्म पूरी तरह से स्वचालित और कंप्यूटर-नियंत्रित माध्यम परिवर्तनों का लाभ प्रदान करते हैं, जिससे संदूषण के जोखिम को संभालने और कम करने में भिन्नता कम हो जाती है। इसके अलावा, लैक्टेट और ग्लूकोज एकाग्रता जैसे पोषक तत्व मापदंडों की लगातार निगरानी की जा सकती है। हालांकि, इन प्रणालियों की स्थापना के लिए अक्सर एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक निवेश, प्रयोगशाला स्थान और योग्य कर्मियों के प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। बेंचटॉप बायोरिएक्टर निलंबन में कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक कॉम्पैक्ट और उपयोग में आसान विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन पोषक तत्वों की समवर्ती निगरानी प्रदान नहीं करता है।
3 डी निलंबन प्लेटफार्मों में कोशिकाओं की खेती के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश प्रोटोकॉल के रूप में, समुच्चय का प्रारंभिक गठन एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है। HIPSC को अनुयायी मोनोलेयर के रूप में सुसंस्कृत किया जाता है और बाद में एकल-सेल निलंबन के रूप में 3 D वातावरण में स्थानांतरित किया जाता है। उस स्तर पर सेल हानि को कम करने के लिए, कई पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। एकीकृत वेवब्रेकर के साथ ट्यूबों के डिजाइन का मतलब है कि इष्टतम मध्यम गड़बड़ी सुनिश्चित करने के लिए प्रति ट्यूब 10 एमएल की न्यूनतम संस्कृति मात्रा की आवश्यकता होती है। इसलिए महत्वपूर्ण मात्रा को लंबी अवधि में कम नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कल्चर वॉल्यूम के प्रति 10 एमएल में 7.5 मिलियन कोशिकाओं का शुरुआती सीडिंग घनत्व, और 60 आरपीएम की घूर्णी गति, अल्पावधि में स्थिर समुच्चय बनाने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है, हालांकि अनुकूलन सेल लाइन पर निर्भर हो सकते हैं।
HIPSC को निलंबन में स्थानांतरित करने के बाद, 24 घंटे के भीतर समुच्चय का गठन किया जाना चाहिए। पहला मध्यम परिवर्तन महत्वपूर्ण है, क्योंकि समुच्चय छोटे हैं और ठीक से व्यवस्थित नहीं हो सकते हैं। समुच्चय के अवसादन के लिए समय बढ़ाया जा सकता है लेकिन 10 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि समुच्चय एक विषम तरीके से टकराना और बढ़ना शुरू कर सकते हैं। आकांक्षा के दौरान, ट्यूब में 5 एमएल की न्यूनतम संस्कृति मात्रा छोड़ी जानी चाहिए, और माध्यम के किसी भी गड़बड़ी से बचा जाना चाहिए। फिर भी, प्रारंभिक चरणों के दौरान कोशिकाओं और समुच्चय के नुकसान की उम्मीद की जाती है। सेल की गिनती संस्कृति में पहले 2 दिनों में एक निरंतर सेल उपज का संकेत देती है, यह दर्शाता है कि एचपीएससी की उच्च प्रोलिफेरेटिव क्षमता प्रारंभिक सेल हानि की भरपाई करती है। एक बार निलंबन में, कोमल खेती और गड़बड़ी समरूप आकार के समुच्चय की ओर ले जाती है जो समय के साथ बढ़ने लगते हैं।
न्यूरोनल भेदभाव डॉक्सीसाइक्लिन-प्रेरित एनजीएन 2 ओवरएक्प्रेशन13 के आधार पर पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था, और व्यक्तिगत चरणों को 3 डी खेती के लिए अनुकूलित किया गया था। न्यूरोनल ट्रांसक्रिप्शन कारक एनजीएन 2 न्यूरोनल भेदभाव में एक अच्छी तरह से वर्णित चालक है और न्यूरोनल प्रेरण को काफी तेज करता है11,13,46। जबकि परिभाषित विकास कारकों के साथ पारंपरिक पैटर्निंग में कई हफ्तों से महीनों तक 7,8,9 लगते हैं, एनजीएन 2 अभिव्यक्ति दिनों के भीतर न्यूरोनल सेल भाग्य को प्रेरित करती है। कम खेती के समय के अलावा, प्रोटोकॉल प्रारंभिक निलंबन संस्कृति के लिए न तो महंगे विकास कारकों और न ही कोटिंग मैट्रिसेस पर निर्भर करता है, इस प्रकार खेती की लागत को अतिरिक्त रूप से कम करता है।
इसके अलावा, अनुगामी और निलंबन संस्कृतियों में अपरिपक्व न्यूरॉन्स की एनजीएन 2-संचालित पीढ़ी की सीधी तुलना से बेंचटॉप बायोरिएक्टर20 का उपयोग करके संस्कृति में 4 दिनों के बाद कोशिकाओं में 1.36 गुना वृद्धि का पता चला, जबकि 1 मिलियन कोशिकाओं के उत्पादन के लिए आवश्यक माध्यम की मात्रा आधी होने की उम्मीद है। इसलिए आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए बेंचटॉप बायोरिएक्टर को नियोजित करना फायदेमंद हो सकता है, क्योंकि कम हैंडलिंग समय और लागत के साथ अधिक संख्या में कोशिकाओं का उत्पादन किया जा सकता है। पिछली रिपोर्टों के अनुरूप, न्यूरोनल वंश प्रतिबद्धता को जल्दी देखा गया था। एनजीएन 2 प्रेरण के 2 दिनों के बाद, शास्त्रीय न्यूरोनल मार्करों जैसे टीयूबीबी 3, एमएपी 2 और एमएपीटी की एक गहन अभिव्यक्ति स्पष्ट थी, जो न्यूरोनल प्रेरण के लिए बेंचटॉप बायोरिएक्टर की प्रयोज्यता का समर्थन करती है। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, संस्कृति के 4 दिनों के भीतर 1 मिलियन HIPSC से लगभग 6.2 मिलियन अपरिपक्व iNGN2 न्यूरॉन्स प्राप्त किए जा सकते हैं। हालांकि, आउटपुट क्षमता अलग-अलग बैचों में भिन्न हो सकती है और सीडिंग पर निलंबन संस्कृति की मात्रा पर निर्भर करती है।
उपज को और बढ़ाने के लिए, खेती का समय 3 अतिरिक्त दिनों के लिए बढ़ाया गया था; हालांकि, हालांकि समुच्चय बड़े हो गए, वे भी अत्यधिक कॉम्पैक्ट हो गए और क्रायोप्रिजर्वेशन या रीप्लेटिंग के लिए ठीक से अलग नहीं किए जा सके। 3 डी संस्कृति दृष्टिकोण में प्रगति के बावजूद, अनुयायी 2 डी न्यूरोनल संस्कृतियां अभी भी माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी या कैल्शियम इमेजिंग जैसे कार्यात्मक विश्लेषण के लिए स्वर्ण मानक हैं। सेल एकवचन इस प्रकार एक समरूप रूप से वितरित न्यूरोनल मोनोलेयर और न्यूरिटिक नेटवर्क के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है। कोशिकाओं की मजबूत यांत्रिक टुकड़ी या कठोर पृथक्करण अभिकर्मकों का उपयोग एकवचन सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है, फिर भी सेल व्यवहार्यता, शरीर विज्ञान और पुन: लगाव क्षमता47,48 पर संभावित प्रभाव के साथ। आगे के विश्लेषण और परिपक्वता के लिए एकल कोशिकाओं की आवश्यकता के संबंध में, निलंबन में 4 दिनों के बाद समुच्चय को अलग कर दिया गया था, और (दिन 2) iNGN2 न्यूरॉन्स क्रायोसंरक्षित थे। आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स के पोस्ट-पिघलने भेदभाव और लक्षण वर्णन ने न्यूरोनल संस्कृतियों की बढ़ती परिपक्वता और घने न्यूरिटिक नेटवर्क के गठन की पुष्टि की।
प्रदान किए गए प्रोटोकॉल से उच्च संख्या में iNGN2 न्यूरॉन्स उत्पन्न होते हैं। हालांकि, कई सीमाओं पर विचार करने की आवश्यकता है। अधिकांश निलंबन संस्कृति प्लेटफार्मों के लिए, 2 डी अनुयायी संस्कृति से 3 डी वातावरण में एचआईपीएससी का स्थानांतरण महत्वपूर्ण है और अक्सर एक गहन सेल हानि से जुड़ा होता है। मीडिया परिवर्तनों के दौरान आगे महत्वपूर्ण सेल और कुल नुकसान की उम्मीद है। स्वचालित प्लेटफार्मों की तुलना में, बेंचटॉप बायोरिएक्टर का उपयोग करके हैंडलिंग समय और संदूषण जोखिम बढ़ जाता है, क्योंकि मध्यम परिवर्तन मैन्युअल रूप से किए जाने चाहिए। स्वचालन की कमी के अलावा, बेंचटॉप बायोरिएक्टर पोषक तत्वों की निगरानी करने की संभावना प्रदान नहीं करता है, और प्रति ट्यूब 50 एमएल की अधिकतम क्षमता प्रोटोकॉल की अपस्केलिंग क्षमता को सीमित करती है। अंत में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, हालांकि एनजीएन 2 न्यूरोनल वंश प्रतिबद्धता को तेज करता है, टर्मिनल परिपक्वता की अवधि कम नहीं होती है और अभी भी कई हफ्तों में दीर्घकालिक संस्कृति की आवश्यकता होती है। न्यूरोनल फ़ंक्शन, अटैचमेंट और उत्तरजीविता49,50,51 के लिए एस्ट्रोसाइटिक समर्थन के महत्व को देखते हुए, सह-संस्कृति दृष्टिकोण पर विचार किया जाना चाहिए, और दीर्घकालिक खेती के लिए भी आवश्यक हो सकता है।
सारांश में, एक बेंचटॉप बायोरिएक्टर को लागू करके आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स की तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी के लिए एक 2 डी भेदभाव प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक 3 डी वातावरण में अनुवाद किया गया था। वर्णित प्रोटोकॉल अच्छी गुणवत्ता वाले, आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की उच्च मात्रा उत्पन्न करता है, जो जटिल मॉडल परीक्षण, उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और बड़े पैमाने पर विषाक्तता परख के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
EBISC2 परियोजना को अनुदान समझौते संख्या 10 के तहत इनोवेटिव मेडिसिन इनिशिएटिव 2 संयुक्त उपक्रम (जेयू) से वित्त पोषण प्राप्त हुआ 821362। जेयू को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम और ईएफपीआईए से समर्थन प्राप्त होता है। हम इम्यूनोसाइटोकेमिकल और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में उनकी सहायता के लिए नादिन जे स्मैंडज़िच, हेलेन डीएम हेमर, जॉन-माजद बाल्स्टर्स और वैनेसा एम नलेवाजा को धन्यवाद देते हैं, साथ ही साथ हेइके आर्थेन को उनके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम बायोरिएक्टर कार्यक्रम की स्थापना के लिए स्टेफ़नी बर को धन्यवाद देते हैं। चित्रा 2 ए BioRender.com के साथ बनाया गया था।
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
Biorender | Biorender.com | ||
BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
Laminin | Merck | L2020 | |
MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
Origin 2021 | OriginLab | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |