Denne artikkelen beskriver en protokoll for generering av humane induserte pluripotente stamcelleavledede nevroner i en stasjonær 3D-suspensjonsbioreaktor.
Avledningen av nevronale avstamningsceller fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) markerte en milepæl i hjerneforskningen. Siden deres første advent har protokoller blitt kontinuerlig optimalisert og er nå mye brukt i forskning og stoffutvikling. Den svært lange varigheten av disse konvensjonelle differensierings- og modningsprotokollene og den økende etterspørselen etter høykvalitets hiPSCer og deres nevrale derivater øker imidlertid behovet for adopsjon, optimalisering og standardisering av disse protokollene til storskala produksjon. Dette arbeidet presenterer en rask og effektiv protokoll for differensiering av genetisk modifiserte, doxycyklininduserbare neurogenin 2 (iNGN2) -uttrykkende hissc i nevroner ved hjelp av en stasjonær tredimensjonal (3D) suspensjonsbioreaktor.
Kort fortalt fikk encellede suspensjoner av iNGN2-hiPSCs lov til å danne aggregater innen 24 timer, og nevronavstamningsforpliktelse ble indusert ved tilsetning av doksycyklin. Aggregater ble dissosiert etter 2 dagers induksjon og celler ble enten kryopreservert eller replisert for terminal modning. De genererte iNGN2-nevronene uttrykte klassiske nevronmarkører tidlig og dannet komplekse nevrittiske nettverk innen 1 uke etter replating, noe som indikerer en økende modenhet av nevronkulturer. Oppsummert er det gitt en detaljert trinnvis protokoll for rask generering av hiPSC-avledede nevroner i et 3D-miljø som har stort potensial som utgangspunkt for sykdomsmodellering, fenotypiske legemiddelscreeninger med høy gjennomstrømning og toksisitetstesting i stor skala.
Nevrologiske lidelser er den ledende årsaken til funksjonshemming over hele verden1. En av seks personer rammes, og forekomsten fortsetter å stige. Den tilhørende økonomiske byrden på samfunn og deres helsevesen er enorm. En evaluering av 30 europeiske land i 2010 anslåtte årlige kostnader på € 800 milliarder knyttet til psykiske og nevrologiske lidelser2. Den økende sosioøkonomiske byrden krever effektive behandlingsstrategier, og selv om vår forståelse av sykdomspatofysiologien har økt betydelig, er omsettingen til klinikk ofte utilstrekkelig. Generelt går bare 12% av legemidlene inn i kliniske studier, hvorav mer enn 80% mislykkes i senere stadier, hovedsakelig på grunn av ineffektivitet eller uventet toksisitet 3,4. Årsakene er varierte, men den begrensede overførbarheten fra dyreforsøk i prekliniske stadier til forsøk på mennesker har i økende grad kommet til syne5. Humane in vitro-celle– og vevsmodeller kan bygge bro over gapet mellom artsoversettelser, og fremskritt innen menneskeindusert pluripotent stamcelleteknologi (hiPSC) har stort potensial i denne forbindelse. hiPSCs er mye brukt i grunnforskning og deler viktige egenskaper med embryonale stamceller (hESCs), for eksempel en nesten ubegrenset selvfornyelseskapasitet og evnen til å differensiere i alle tre kimlag6, mens man omgår etiske bekymringer knyttet til embryodestruksjon.
Avledningen av nevronceller fra hESCs, og senere hiPSCs, markerte en milepæl i hjerneforskningen. Innledende differensieringsprotokoller var basert på anvendelse av vekstfaktorer som etterlignet kritiske trinn under embryogenese, de fleste av dem involverte dobbel SMAD-hemming enten i suspensjon eller adherentkulturer 7,8,9. Eldre nevroner har blitt generert, men flere ulemper ved disse protokollene hindrer fortsatt deres brede bruk i stoffutvikling, for eksempel lavt utbytte og høy batch-til-batch-variabilitet av genererte nevroner, samt den omfattende arbeidsbelastningen knyttet til lange kulturtider. Forbedringer har blitt oppnådd ved tvungen ekspresjon av transkripsjonsfaktorer som er kritisk involvert i nevrogenese, og medlemmer av nevrogeninfamilien (NGN), spesielt NGN2, har blitt identifisert som effektive drivere10. Det lentiviralmedierte ektopiske uttrykket av NGN2 i hiPSCs akselererte tidlige stadier av nevrondifferensiering signifikant, og induserte nevroncelleskjebne innen bare 1 uke11. Etterfølgende terminal modning i kokulturer med astrocytter ga funksjonelle nevroner i høy renhet og mengde med reproduserbare egenskaper. Stedsrettet genredigering av adenoassosiert virusintegrasjonssted 1 (AAVS1) safe-harbor locus ble deretter brukt for å lage hiPSC-linjer med en stabil og doksycyklininduserbar ekspresjonskassett for NGN212,13, og dermed minimere uønskede bivirkninger av lentiviral levering.
Den robuste og effektive differensieringen av doksysyklininduserbare neurogenin 2 (iNGN2) nevroner har stort potensial for fenotypiske medikamentscreeninger med høy gjennomstrømning og toksisitetsanalyser10,14,15; Og det er gjort betydelige fremskritt i bioprosessering i løpet av det siste tiåret med implementering av bioreaktorer for en skalerbar celleutvidelse og differensiering16,17,18,19. Imidlertid er de fleste differensieringsprotokoller optimalisert for adherente kulturer, og oversettelse til et tredimensjonalt (3D) miljø krever ofte viktige modifikasjoner. Nylig har vellykket bruk av en stasjonær 3D-bioreaktor med reduserte skjærspenningsfunksjoner blitt rapportert for utvidelse av hissc og for reproduserbar differensiering i hepatocytter, kardiomyocytter og nevroner20. Her er en detaljert protokoll for generering og karakterisering av iNGN2-nevroner gitt ved hjelp av den identiske benchtop 3D-bioreaktoren.
Det ektopiske uttrykket av den nevronale transkripsjonsfaktoren NGN2 har tidligere vist seg å akselerere tidlige stadier av nevronal differensiering og indusere nevronavstamningsforpliktelse i hissc innen 1 uke etter dyrking12,13,20. Dette arbeidet beskriver en detaljert protokoll for differensiering av genredigerte BIONi010-C-13 hiPSCs til iNGN2-nevroner ved hjelp av en stasjonær bioreaktor.
CERO 3D bioreaktor er en lavvolum bioreaktor med fire spor for spesialiserte rør, hver med en maksimal kapasitet på 50 ml. Temperatur og CO2 -nivåer kontrolleres kontinuerlig og dyrkingsparametere (f.eks. rotasjonshastighet og tid) reguleres for hvert rør, uavhengig av hverandre slik at brukerne kan kjøre flere differensieringsmetoder parallelt. Integrerte bølgebrytere på den indre rørveggen tillater forstyrrelse av mediet med lav skjærspenning og opprettholder 3D-aggregater i suspensjon under kontrollert rotasjon. Begrenset tilgang til næringsstoffer, samt påtvungne 3D-celle- og celleekstracellulære matriseinteraksjoner (ECM), kan påvirke cellulær differensiering og oppførselbetydelig 24,25,26,27.
Dyrking av celler som 3D-aggregater i suspensjon øker disse celleinteraksjonene, og etterligner dermed in vivo-miljøet i vev eller organer nærmere28. Den samtidige forstyrrelsen av mediet regulerer aggregatstørrelsen på grunn av mekanisk friksjon, forbedrer gassutvekslingen og reduserer gradienten av næringsstoffer og avfall i røret, samtidig som fysiologiske relevante gradienter inne i aggregatene bevares 29,30,31,32,33,34. Selv om middels endringer utføres manuelt, reduserer den stasjonære bioreaktoren arbeids- og driftskostnader sammenlignet med statiske kulturkolber. Bioreaktoren gir også flere fordeler i forhold til helautomatiske omrøringsbioreaktorer, da impellerfri design reduserer hydrodynamisk skjærspenning på den samlede overflaten, og dermed ikke bare forbedrer celleoverlevelse, men begrenser også effekten av skjærspenning på følsomme iPSCer, celledifferensiering og funksjon35,36,37,38.
Vertikale hjulbioreaktorer, hvor celler omrøres av et stort vertikalt løpehjul, samt gyngebevegelsesbioreaktorer ved hjelp av oppblåste kulturposer festet til en motorisert plattform, representerer alternative 3D-fjæringsplattformer. Selv om det er overdrevent testet for dyrking av hiPSCs 17,18,19,39,40, er lite kjent om deres anvendelighet i nevrondifferensieringstilnærminger, og rapporter er begrenset til vellykket utvidelse av pattedyrs og humane nevrale forløperceller i røretankbioreaktorer 41,42,43,44, med et sjeldent antall studier som fokuserer på modning44,45. Generelt gir automatiserte 3D-hengeplattformer fordelen av helautomatiske og datastyrte mediumendringer, og reduserer dermed variasjoner i håndtering og minimerer risikoen for kontaminering. Videre kan næringsparametere som laktat- og glukosekonsentrasjon overvåkes kontinuerlig. Imidlertid krever etableringen av disse systemene ofte en betydelig innledende investering, laboratorieplass og opplæring av kvalifisert personell. Den stasjonære bioreaktoren representerer et kompakt og brukervennlig alternativ for dyrking av celler i suspensjon, men gir ikke samtidig overvåking av næringsstoffer.
Som i de fleste protokoller som brukes til dyrking av celler i 3D-suspensjonsplattformer, representerer den første dannelsen av aggregater et kritisk trinn. hiPSCer dyrkes som adherente monolag og overføres deretter som encellesuspensjoner til et 3D-miljø. For å minimere celletap på det stadiet, må flere aspekter vurderes. Utformingen av rørene med de integrerte bølgebryterne betyr at et minimalt kulturvolum på 10 ml per rør er nødvendig for å sikre optimal medium forstyrrelse. Det kritiske volumet bør derfor ikke undergraves på lang sikt. Videre anbefales en startsåingstetthet på 7,5 millioner celler per 10 ml kulturvolum, og en rotasjonshastighet på 60 o / min, for å danne stabile aggregater på kort sikt, selv om tilpasninger kan være nødvendige avhengig av cellelinjen.
Etter overføring av hiPSCs til suspensjon, bør aggregater dannes innen 24 timer. Den første medieendringen er kritisk, da aggregatene er små og kanskje ikke legger seg ordentlig. Tiden for sedimentering av aggregater kan forlenges, men bør ikke overstige mer enn 10 min, da aggregater kan begynne å klumpe seg og vokse på en heterogen måte. Under aspirasjon bør et minimalt kulturvolum på 5 ml være igjen i røret, og eventuelle forstyrrelser i mediet bør unngås. Likevel må man forvente tap av celler og aggregater i de innledende fasene. Celletall indikerer et konstant celleutbytte i løpet av de første 2 dagene i kultur, noe som indikerer at den høye proliferative kapasiteten til hiPSCs kompenserer for det første celletapet. Når den er i suspensjon, fører den milde dyrkingen og forstyrrelsen til homogent store aggregater som begynner å vokse over tid.
Neuronal differensiering ble utført i henhold til en tidligere publisert protokoll basert på doksysyklinindusert NGN2-overekspresjon13, og de enkelte trinnene ble optimalisert for en 3D-dyrking. Den neuronale transkripsjonsfaktoren NGN2 er en velbeskrevet driver i nevronal differensiering og akselererer nevroninduksjon signifikant11,13,46. Mens konvensjonelt mønster med definerte vekstfaktorer tar flere uker til måneder 7,8,9, induserer NGN2-ekspresjon nevroncelleskjebne i løpet av dager. I tillegg til den forkortede dyrkingstiden er protokollen verken avhengig av dyre vekstfaktorer eller beleggmatriser for den første opphengskulturen, og reduserer dermed dyrkingskostnadene ytterligere.
Videre viste en direkte sammenligning av den NGN2-drevne generasjonen av umodne nevroner i adherente og suspensjonskulturer en 1,36 ganger økning i celler etter 4 dager i kultur ved bruk av den stasjonære bioreaktoren20, mens volumet av medium som kreves for generering av 1 million celler forventes å bli halvert. Bruk av stasjonær bioreaktor for generering av iNGN2-nevroner kan derfor være fordelaktig, da et høyere antall celler kan produseres med lavere håndteringstid og kostnad. I tråd med tidligere rapporter ble nevronal avstamningsforpliktelse observert tidlig. Etter 2 dager med NGN2-induksjon var et dypt uttrykk for klassiske nevronmarkører som TUBB3, MAP2 og MAPT tydelig, noe som støttet anvendeligheten av den stasjonære bioreaktoren for nevronal induksjon. Etter denne protokollen kan omtrent 6,2 millioner umodne iNGN2-nevroner fås fra 1 million hissc innen 4 dager etter kultur. Utgangskapasiteten kan imidlertid variere mellom partier og avhenge av volumet av suspensjonskultur ved såing.
For å øke utbyttet ytterligere ble dyrkingstiden forlenget i ytterligere 3 dager; Men selv om aggregatene ble større, ble de også svært kompakte og kunne ikke ordentlig dissosieres for kryopreservering eller replating. Til tross for fremskritt innen 3D-kulturtilnærminger, er adherente 2D-nevronkulturer fortsatt gullstandarden for funksjonelle analyser som mikroelektroderader eller kalsiumavbildning. Cellesingularisering er dermed en viktig forutsetning for et homogent fordelt nevronalt monolag og nevrittisk nettverk. Sterkere mekanisk løsrivelse av cellene eller harde dissosiasjonsreagenser kan brukes til å sikre singularisering, men med potensielle effekter på celle levedyktighet, fysiologi og re-vedleggskapasitet47,48. Med hensyn til behovet for enkeltceller for videre analyser og modning, ble aggregater dissosiert etter 4 dager i suspensjon, og (dag 2) iNGN2-nevronene kryopreservert. Post-tine differensiering og karakterisering av iNGN2 nevroner bekreftet en økende modenhet av nevronkulturer og dannelsen av et tett neurittisk nettverk.
Den medfølgende protokollen gir et høyt antall iNGN2-nevroner. Det er imidlertid flere begrensninger som må vurderes. Som for de fleste suspensjonskulturplattformer, er overføringen av hiPSCs fra en 2D-tilhengerkultur til et 3D-miljø kritisk og ofte forbundet med et dypt celletap. Ytterligere betydelig celle- og aggregert tap forventes under medieendringer. Sammenlignet med automatiserte plattformer økes håndteringstiden og forurensningsrisikoen ved bruk av den stasjonære bioreaktoren, da middels endringer må utføres manuelt. Bortsett fra mangel på automatisering, tilbyr ikke den stasjonære bioreaktoren muligheten til å overvåke næringsstoffene, og den maksimale kapasiteten på 50 ml per rør begrenser oppskaleringspotensialet til protokollen. Til slutt er det viktig å merke seg at selv om NGN2 akselererer neuronal avstamningsforpliktelse, blir varigheten av terminal modning ikke forkortet og krever fortsatt langsiktig kultur over flere uker. Gitt viktigheten av astrocytisk støtte for nevronfunksjon, tilknytning og overlevelse 49,50,51, bør samkulturtilnærminger vurderes, og kan til og med være avgjørende for langsiktig dyrking.
Oppsummert ble en 2D-differensieringsprotokoll vellykket oversatt til et 3D-miljø for rask og reproduserbar generering av iNGN2-nevroner ved å implementere en stasjonær bioreaktor. Den beskrevne protokollen gir høye mengder av iPSC-avledede nevroner av god kvalitet, som kan tjene som utgangspunkt for kompleks modelltesting, legemiddelscreeninger med høy gjennomstrømning og toksisitetsanalyser i stor skala.
The authors have nothing to disclose.
EBiSC2-prosjektet har mottatt støtte fra Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) under tilskuddsavtale No 821362. JU mottar støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 og EFPIA. Vi takker Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters og Vanessa M. Nalewaja for deres hjelp med immuncytokjemiske og genuttrykksanalyser, samt Heike Arthen for hennes utmerkede tekniske støtte. Videre takker vi Stephanie Bur for etableringen av bioreaktorprogrammet. Figur 2A ble laget med BioRender.com.
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
Biorender | Biorender.com | ||
BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
Laminin | Merck | L2020 | |
MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
Origin 2021 | OriginLab | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |