Vi presenterer en protokoll for dyrking av høyreproduserbare sfæroider og deres fenotypiske karakterisering ved hjelp av bildeopptak og proteomikk.
Vi presenterer en protokoll som beskriver egenskapene og fordelene ved å bruke en frittstående klinostatinkubator for dyrking, behandling og overvåking av 3D-cellekulturer. Klinostaten etterligner et miljø der celler kan samle seg som svært reproduserbare sfæroider med lave skjærkrefter og aktiv næringsdiffusjon. Vi demonstrerer at både kreft og ikke-kreft hepatocytter (HepG2 / C3A og THLE-3 cellelinjer) krever 3 ukers vekst før man oppnår funksjoner som kan sammenlignes med leverceller. Denne protokollen fremhever bekvemmeligheten ved å bruke inkubatorer for 3D-celler med kameraer som overvåker celleveksten, da øyeblikksbilder kan tas for å telle og måle sfæroider ved behandling. Vi beskriver sammenligningen av THLE-3 og HepG2 / C3A cellelinjer, som viser hvordan ikke-kreftcellelinjer kan dyrkes så vel som udødeliggjorte kreftceller. Vi demonstrerer og illustrerer hvordan proteomikkeksperimenter kan utføres fra noen få sfæroider, som kan samles uten perturbing cellesignalering, dvs. ingen trypsinisering nødvendig. Vi viser at proteomikkanalyse kan brukes til å overvåke den typiske leverfenotypen av respiratorisk kjedemetabolisme og produksjon av proteiner involvert i metallavgiftning og beskrive et halvautomatisert system for å telle og måle sfæroidens område. Til sammen presenterer protokollen en verktøykasse som består av en fenotypisk karakterisering via bildeopptak og en proteomikkrørledning for å eksperimentere med 3D-cellekulturmodeller.
In vitro cellekulturer har vist seg å være nødvendige og uvurderlige for å etablere grunnleggende kunnskap i biologi. Mye av den vitenskapelige forståelsen i biologi og kreft spesifikt har kommet fra 2D-kultursystemet som er celler som vokser i et monolag. Selv om 2D-kultur har vært det dominerende cellekultursystemet, har det mange ulemper som potensielt kan kvele ytterligere biologiske fremskritt. For eksempel mangler 2D-kulturer celle-celle-interaksjoner som er viktige for cellesignalering og spredning1. Hittil har 3D-kultursystemer vist seg å bedre modelldifferensiering, legemiddelrespons, tumorinvasjon og biologi 2,3,4,5. 3D-modellering av ondartede kreftformer er spesielt viktig på grunn av økningen i den aldrende befolkningen og kreftdødeligheten. Hepatocellulært karsinom (HCC) er en av de viktigste årsakene til kreftrelatert dødelighet over hele verden og har ofte en elendig prognose6. HCC er kjent for å ha en lav kurrate, dårlig legemiddelrespons og høy grad av gjentakelse 6,7,8. Flere 3D-modeller for normal lever og HCC er utviklet som etterligner fysiologien til in vivo normalt og ondartet levervev 9,10.
Noen av de nåværende 3D-systemene inkluderer flytende overlegg, bioreaktorer, hydrogel, stillaser og 3D-trykte strukturer. Sfæroider generert i bioreaktorer gir spesielt unike fordeler fordi de etterligner tumorfordeling av næringseksponering, gassutveksling og celleproliferasjon / ro11. Bioreaktorer er spesielt egnet for kreftmodeller på grunn av deres brukervennlighet, store skalerbarhet, næringsdiffusjon, og tilgjengelighet11. I tillegg kan bioreaktorer tillate eksperimenter med høy gjennomstrømning, større reproduserbarhet og redusert menneskelig feil. Bioreaktoren som brukes i denne studien er unik fordi den simulerer et system med redusert tyngdekraft, noe som minimerer forstyrrende skjærkrefter som brukes i typiske bioreaktorer, noe som muliggjør bedre reproduserbarhet12. Den omnidireksjonelle tyngdekraften og reduksjonen i skjærkrefter gjør det mulig for cellene å utvikle seg på en mer fysiologisk måte. Som bevis utvikler HepG2 / C3A-celler dyrket under denne metoden sfæriske organeller som produserer in vivo nivåer av ATP, adenylatkinase, urea og kolesterol13,14. I tillegg er medikamentelle behandlinger i dette 3D-systemet mer avanserte og automatiserte i forhold til 2D-kulturer. I 2D-kulturer må medikamentelle behandlinger ofte ha et kort tidsforløp på grunn av behovet for å trypsinisere og opprettholde cellehelse. Likevel, i vårt tilfelle, kan vi utføre langsiktige medikamentelle behandlinger av sfæroider uten å måtte forstyrre cellens struktur og fysiologi. Derfor er et skifte fra 2D til 3D-kulturer nødvendig for å bedre modellere in vivo biologiske fenomener og videre vitenskapelig utvikling.
Denne artikkelen presenterer en metodikk for dyrking av høyreproduserbare sfæroider (figur 1 og figur 2) og viser et halvautomatisert system for fenotypisk karakterisering av 3D-strukturer (figur 3). På bildenivå gir vi informasjon om telling og måling av sfæroidenes areal (figur 3). Ved hjelp av massespektrometrimetoder viser vi hvordan proteomikk kan brukes til å vurdere spesifikke biologiske funksjoner (figur 4). Ved å samle og analysere disse dataene håper vi å forbedre forståelsen av biologien bak 3D-cellekultursystemer.
Å forstå biologien bak tredimensjonale (3D) cellulære strukturer er ekstremt viktig for en mer omfattende kunnskap om deres funksjonalitet. Det er en økende interesse for å bruke 3D-modeller for å studere kompleks biologi og utføre toksisitetsscreening. Ved dyrking av celler i 3D må mange faktorer vurderes, inkludert fenotypisk vurdering av modellsystemet. En fenotype er definert som en gruppe observerbare egenskaper hos en bestemt organisme, som morfologi, oppførsel, fysiologiske og biokjemiske egenskaper20.
I denne protokollen demonstrerer vi hvordan proteomikkeksperimenter kan utføres fra noen få sfæroider og kan brukes til å overvåke den typiske leverfenotypen. Massespektrometri har blitt en omfattende anvendt metode for 3D-cellekarakterisering, noe som gjør det mulig å undersøke en rekke biologiske spørsmål 12,16,21,22. For en omfattende proteomanalyse anbefales det å bruke minst 20 μg proteinutgangsmateriale, hvorfra 1 μg injiseres i massespektrometeret. Det er viktig å nevne at å legge til mindre prøve kan føre til tap av følsomhet, og å legge til flere vil gradvis forverre kvaliteten på kromatografien og til slutt føre til blokkering av kolonnen. I denne studien viste vi at HepG2 / C3A og THLE-3 sfæroider er beriket med viktige proteiner fra glykolyse og TCA-syklus, som er spesifikke leverveier og er kritiske for å opprettholde blodsukkernivået og for energiproduksjon23,24. Faktisk gir massespektrometrianalyse ikke bare informasjon på proteinnivå, men tillater også undersøkelse av protein posttranslasjonelle modifikasjoner, som vist tidligere av vår gruppe16.
Et annet aspekt som skal vurderes i 3D-fenotypiske studier er antallet og størrelsen på sfæroider. I tillegg til å gjøre eksperimenter mer reproduserbare, er det viktig å telle antall sfæroider og bestemme størrelsen for å bestemme når kulturen skal deles i flere bioreaktorer, da antall 3D-strukturer i et fartøy kan påvirke sfæroiders størrelse og metabolske aktivitetsnivåer. Det er imidlertid viktig å fremheve at antall og størrelse på sfæroider avhenger av cellelinjen, startantall celler, delingsprosess og tidspunkt for innsamling. Detaljer om HepG2 / C3A sfæroidkultur, for eksempel antall celler per sfæroider, proteininnhold og størrelse som en funksjon av alder, ble gitt av Fey, Korzeniowska og Wrzesinski25. For nøyaktig og vellykket analyse ved hjelp av den halvautomatiserte metoden beskrevet her, er det mest kritiske trinnet et godt sfæroidbilde. For enkelhets skyld kan bildet tas med en telefon eller nettbrett, men oppløsningen bør holdes så høy som mulig. Siden bildene er raske å tilegne seg, tillater de storskala screeningeksperimenter for å visualisere spesifikke fenotypiske trekk eller undersøke respons på narkotikabehandling. Derfor, på grunn av det økende antallet cellebaserte analyser, har en rekke åpen kildekode-programvare blitt utviklet de siste 10 årene for bildeanalyse26. I denne protokollen beskriver vi et halvautomatisert system ved hjelp av programvaren FIJI18 for å telle og måle sfæroidenes størrelse. Vi presenterte skript (enkle programmeringskommandoer) for å definere en sekvens av algoritmiske operasjoner som kan brukes på en bildesamling, noe som gjør analysen til en enkel og rask prosess. Imidlertid, avhengig av karakteristikken til sfæroiden, bør en manuell måling anvendes. For eksempel, hvis sfæroidene er for gjennomsiktige, vil FIJI-skriptet være upresis. Forresten, et av de viktigste kriteriene for at denne metoden skal fungere, er kompaktiteten til sfæroidene. Denne egenskapen vil bidra til en mer forbedret fargekontrast mellom sfæroidene og bakgrunnen, noe som er nødvendig for at metoden skal være nøyaktig.
Oppsummert, foruten å presentere en metodikk for dyrking av høyreproduserbare sfæroider, ble det også beskrevet et halvautomatisert system kombinert med fenotypisk karakterisering via bildeopptak og proteomikk. Vi forventer at denne verktøykassen for analyse av 3D-celler vil bli mer robust med fullautomatisert bildeanalyseprogramvare og neste generasjons massespektrometre.
The authors have nothing to disclose.
Sidoli-laboratoriet anerkjenner takknemlig Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck og NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
DTT | Sigma | D0632-5G | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
Formic acid | Thermo | 28905 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
hEGF | Corning | 354052 | |
HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
PAULA microscope | Leica | ||
Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
pH paper | Hydrion | 93 | |
Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
Sterile hood | Thermo | 1375 | |
Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
Vortex | Sigma | Z258415 | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |