여기에서 우리는 닭 배아의 celomic cavity에서 신장 오가노이드의 이식을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 성숙 향상을 유도하고 이러한 과정을 효율적인 방식으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
닭 배아에서 Intracelomic Transplantation을 통한 신장 오가노이드의 효율적인 혈관 형성
이 논문에서
요약
초록
인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 신장 오가노이드는 성인 신장의 것과 어느 정도 유사한 네프론 유사 구조를 포함합니다. 불행하게도, 그들의 임상적 적용 가능성은 기능적 맥관 구조의 부족과 결과적으로 시험관 내 성숙이 제한되어 방해를 받습니다. 닭 배아의 celomic cavity에 신장 오가노이드를 이식하면 사구체 모세 혈관 형성을 포함하여 관류 된 혈관에 의한 혈관 형성을 유도하고 성숙을 향상시킵니다. 이 기술은 매우 효율적이어서 많은 수의 오가노이드를 이식하고 분석할 수 있습니다. 이 논문은 닭 배아에서 신장 오가노이드의 뇌내 이식에 대한 자세한 프로토콜을 설명한 후 관류된 혈관 구조를 염색하기 위해 형광 표지된 렉틴을 주입하고 이미징 분석을 위해 이식된 오가노이드를 수집합니다. 이 방법은 오가노이드 혈관화 및 성숙을 유도 및 연구하여 시험관 내에서 이러한 과정을 향상시키고 질병 모델링을 개선하기 위한 단서를 찾는 데 사용할 수 있습니다.
서론
인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 신장 오가노이드는 발달 연구 1,2,3,4, 독성 스크리닝 5,6 및 질병 모델링5,7,8,9,10,11,12,13에 대한 잠재력이 있는 것으로 나타났습니다 . 그러나 이러한 목적 및 궁극적인 임상 이식 목적에 대한 적용 가능성은 혈관 네트워크의 부족으로 인해 제한됩니다. 배아 신장 발달 동안 족세포, 간질 세포 및 혈관 내피 세포(EC)가 상호 작용....
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프로토콜
네덜란드 법에 따라이 연구에는 동물 복지위원회의 승인이 필요하지 않았습니다.
1. 이식을 위한 hiPSC 유래 신장 오가노이드 준비
- Takasato et al.4,18,31에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 hiPSC를 신장 오가노이드로 구별합니다. 분화 7일 + 12일까지 0.4μm 공극이 있는 폴리에스터 세포 배양 삽입물(세포 배양 삽입물)에서 이 프로토콜에 따라 오가노이드를 배양합니다. 각 세포 배양 삽입물에는 3개의 오가노이드가 포함됩니다.
- 세포 배양 삽입물에서 오가노이드를 제거합니다.
- 한 쌍의 해부 집게로 세포 배양 삽입물의 막 중간에 구멍을 뚫습니다. 해부 가위를 사용하여 세포 배양 삽입물의 중간에 있는 구멍에서 가장자리까지 막을 세 번 절단하여 오가노이드 사이를 절단합니다. 이렇게 하면 각각 하나의 오가노이드가 부착된 3개의 멤브레인 조각이 생성되며, 이 멤브레인은 여전히 바깥쪽 가장자리의 세포 배양 삽입물에 연결되어 있습니다.
- 한 쌍의 집게로 바깥쪽 가장자리에 가까운....
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결과
hiPSC를 신장 오가노이드로 분화하는 방법과 일정, 수정된 닭 알의 배양, 신장 오가노이드의 이식, LCA 주입 및 오가노이드 수집을 위한 방법이 그림 1A에 요약되어 있습니다. 오가노이드 분화와 닭고기 달걀 부화의 시기를 조정하고 부화 15일 전에 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 배양 0일, 3일, 4일, 12일의 행동은 타임라인 아래의 사진으로 설명됩니다. 오가노이드는 분화 7일째 + 12일째에 4일째(HH 23-24) 닭 배아로 이식됩니다. LCA는 이식 후 8일 후에 배아의 정맥계에 주입하여 관류된 혈관 구조를 염색한 후 배아를 희생하고 오가노이드를 회수합니다. 조립된 사출 시스템은 그림 1B에 나와 있습니다.
닭 배아는 배양 12일째에 희생된다(도 1A). 배아를 조심스럽게 해부하면 이식된 오가노이드가 일반적.......
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토론
이 원고에서는 닭 배아에서 hiPSC 유래 신장 오가노이드의 뇌내 이식을 위한 프로토콜이 시연됩니다. 이식 시 오가노이드는 인간 오가노이드 유래 EC와 닭 유래 EC의 조합으로 구성된 관류 혈관에 의해 혈관화됩니다. 이들은 오가노이드 전체에 퍼져 사구체 구조를 침범하여 EC와 족세포 사이의 상호 작용을 가능하게 합니다. 이전에 이것이 오가노이드 사구체 및 관형 구조의 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다28. 이식은 배아당 ~5분이 소요되는 매우 효율적이며 배아에 필요한 유일한 유지 관리는 인큐베이터의 물동이를 정기적으로 채우는 것입니다. 따라서 이 방법은 많은 수의 오가노이드 분석에 매우 적합합니다.
신장 오가노이드의 혈관화 및 성숙은 이전에 마우스18,20에서의 이식을 통해 입증되었습니다. 이러한 노동 집약적인 마우스 모델에서 오가노.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
닭 배아 주입에 도움을 준 George Galaris(LUMC, Leiden, Netherlands)에게 감사드립니다. 우리는 Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, the Netherlands), Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, the Netherlands)의 지원을 인정합니다. M. Koning은 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'에 의해 지원됩니다. 이 작업은 Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02의 일부 지원을 받았습니다. 이 작업은 RegMedXB (Regenerative Medicine Crossing Borders)와 Health Holland, To....
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재료
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| 0.2 & 마이크로; m 필터: Whatman Puradisc 30 주사기 필터 0.2 &마이크로; m | Whatman | 10462200 | |
| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| 아스피레이터 튜브 어셈블리 보정된 마이크로캐필러리 피펫용 | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | 실리콘 튜브, 입 부분 및 커넥터 포함 |
| 컨포칼 현미경: Leica White Light Laser Confocal Microscope | 라이카 | TCS SP8 | |
| 절개 겸자, 심플 타입. 티타늄, 곡선, 미세하고 날카로운 팁이 있는 | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| 해부 겸자, 심플 타입. 티타늄, 직선, 세밀하고 날카로운 팁이 있는 | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| 해부 현미경 | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| 해부 가위, 곡선, OP-특수, 매우 날카롭고 날카로운 | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| 당나귀 세럼 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 당나귀-알파;-마우스 Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | 희석 1:500 |
| 당나귀-알파;-양 Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | 희석 1:500 |
| 양단 스테인리스 스틸 면도날 | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, 칼슘, 마그네슘 (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| 계란 상자 또는 맞춤 제작 계란 홀더 | NA | ||
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| 마이크로 가위, 직선, 날카로움/날카로움, 절단 길이 10mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
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| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 텅스텐 와이어, 지름 0.25mm | 써모피셔 사이언티픽 | 010404.H2 |
참고문헌
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al.
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