Detta protokoll bedömer Drosophilas rörelseaktivitet genom att spåra och analysera flugornas rörelse i en handgjord arena med hjälp av öppen källkodsprogramvara Fiji, kompatibel med plugins för att segmentera pixlar i varje ram baserat på högupplöst videoinspelning för att beräkna parametrar för hastighet, avstånd etc.
Drosophila melanogaster är en idealisk modellorganism för att studera olika sjukdomar på grund av dess överflöd av avancerade genetiska manipulationstekniker och olika beteendefunktioner. Att identifiera beteendebrist i djurmodeller är ett avgörande mått på sjukdomens svårighetsgrad, till exempel vid neurodegenerativa sjukdomar där patienter ofta upplever nedsatt motorisk funktion. Men med tillgången till olika system för att spåra och bedöma motoriska underskott i flugmodeller, såsom läkemedelsbehandlade eller transgena individer, saknas fortfarande ett ekonomiskt och användarvänligt system för exakt utvärdering från flera vinklar. En metod baserad på AnimalTracker applikationsprogrammeringsgränssnitt (API) utvecklas här, vilket är kompatibelt med Fiji bildbehandlingsprogram, för att systematiskt utvärdera rörelseaktiviteterna hos både vuxna och larvala individer från inspelad video, vilket möjliggör analys av deras spårningsbeteende. Denna metod kräver endast en HD-kamera och en hårdvaruintegration för kringutrustning för att spela in och analysera beteende, vilket gör det till ett prisvärt och effektivt tillvägagångssätt för screening av flugmodeller med transgena eller miljömässiga beteendebrister. Exempel på beteendetester med farmakologiskt behandlade flugor ges för att visa hur teknikerna kan upptäcka beteendeförändringar hos både vuxna flugor och larver på ett mycket repeterbart sätt.
Drosophila melanogaster ger en utmärkt modellorganism för att undersöka cellulära och molekylära funktioner i neuronala sjukdomsmodeller skapade av genmodifiering1, läkemedelsbehandling2 och åldrande3. Det höga bevarandet av biologiska vägar, fysikaliska egenskaper och sjukdomsassocierade homologgener mellan människor och Drosophila gör att fruktflugan gör att fruktflugan är en idealisk efterlikning från molekylär till beteendenivå4. I många sjukdomsmodeller är beteendebrist ett viktigt index, vilket ger en användbar modell för olika mänskliga neuropatier 5,6. Drosophila används nu för att studera flera mänskliga sjukdomar, neurodevelopment och neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom och amyotrofisk lateralskleros 7,8. Att detektera sjukdomsmodellernas motoriska förmåga är avgörande för att förstå det patogena framsteget och kan ge en fenotypisk korrelation till de molekylära mekanismerna bakom sjukdomsprocessen.
Nyligen har kommersiellt tillgängliga mjukvaruverktyg och kostnadseffektiva program utvecklats för Drosophila lokomotoriska detektionsstrategier, såsom testning med hög genomströmning i grupperade flugor9,10 och mätning av rörelse i realtid11,12. Ett sådant konventionellt tillvägagångssätt är snabb interaktiv negativ geotaxi (RING), även kallad klättringsanalysen, som inkluderar flera kanaler som gör det möjligt att innehålla en stor flugpopulation med samma kön och ålder, vilket minskar variationen medan data samlar in 9,13. En annan förtestmetod för att analysera lokomotoriskt beteende är TriKinetics Drosophila aktivitetsmonitor (DAM), en enhet som använder flera strålar för att detektera flugaktivitetsrörelse i ett tunt glasrör14. Enheten registrerar position kontinuerligt, vilket representerar automatiserad rörelse genom att beräkna strålkorsningarna för att studera flugornas aktivitet och dygnsrytm under en längre tidsperiod15. Även om dessa metoder har använts i stor utsträckning för att analysera beteendefel hos fruktflugor för att bestämma förändringar i beteendemässig rörelse, kräver de alltid speciell testutrustning eller komplexa analysprocesser och begränsar deras tillämpning i vissa modeller med en begränsad, enkel enhet. Djurspårningsgruppbaserade strategier för testning av den vuxna Drosophila, såsom FlyGrAM11 och Drosophila island assay10, implementerar social rekrytering och individuell spårning i ett fördefinierat område. Icke desto mindre kan social individuell begränsning i trotsiga områden ha en negativ inverkan på identifieringen i bilderna, orsakad av kollision eller överlappning av flugor. Även om vissa materialbaserade metoder med öppen källkod, som TRex16, MARGO 12 och FlyPi17, har en nödsituation, kan de snabbt spåra flugorna med flexibel användning i beteendetestning. Dessa testmetoder är förknippade med utarbetade experimentella apparatinstallationer, speciella programvarukrav eller professionella datorspråk. För larver är mätning av det totala avståndet som reste över antalet rutnätgränslinjer per tidsenhet18, eller grovräkning av kroppsväggkontraktionerna för individer manuellt19, de dominerande metoderna för att bedöma deras rörelseförmåga. På grund av bristen på precision i utrustning eller anordningar och analysmetoder kan viss beteendemässig rörelse av larver undgå upptäckt, vilket gör det svårt att exakt bedöma beteenderörelser, särskilt fin rörelse15.
Den nuvarande utvecklade metoden använder AnimalTracker applikationsprogrammeringsgränssnitt (API), kompatibelt med Fiji (ImageJ) bildbehandlingsprogram, för att systematiskt utvärdera rörelseaktiviteten hos både vuxna och larvflugor genom att analysera deras spårningsbeteende från högupplösta (HD) videor. Fiji är en ImageJ-distribution med öppen källkod som kan kombinera robusta programvarubibliotek med många skriptspråk, vilket resulterar i snabb prototypning av bildbehandlingsalgoritmer, vilket gör den populär bland biologer för sina bildanalysfunktioner20. I det nuvarande tillvägagångssättet utnyttjas Fijis integration i AnimalTracker API för att utveckla en unik Drosophila-beteendeanalys med personlig algoritminsättning och ger ett användbart steg för detaljerad dokumentation och handledning för att stödja robusta analytiska funktioner för lokomotoriskt beteende (figur 1). För att kringgå komplikationen av objektiva identifieringar i bilderna som orsakas av kollision eller överlappning av flugor, är varje arena begränsad till att vara värd för endast en fluga. Vid bedömning av metodens spårningsprecision implementerades det för att spåra och kvantifiera rörelserörelserna hos Drosophila som administrerades med det toxiska läkemedlet rotenon, som vanligtvis används för djurmodeller av Parkinsons sjukdom, och slutligen upptäckte rörelsenedsättning i läkemedelsbehandlingen21. Denna metod, som använder öppen källkod och fri programvara, kräver inte högkostnadsinstrumentering och kan exakt och reproducerbart analysera Drosophila beteenderörelse.
Vi har utformat en metod, baserad på materialet AnimalTracker API med öppen källkod som är kompatibelt med Fijis bildbehandlingsprogram, som kan göra det möjligt för forskare att systematiskt utvärdera rörelseaktivitet genom att spåra både vuxna och enskilda larvflugor. AnimalTracke är ett verktyg skrivet i Java som enkelt kan integreras i befintliga databaser eller andra verktyg för att underlätta analysen av applikationsdesignat djurspårningsbeteende24. Efter en …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en särskild lanseringsfond från Soochow University och National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). Vi tackar professor Chunfeng Lius labbmedlemmar för deras diskussion och kommentarer.
Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |