Den nåværende protokollen vurderer den lokomotoriske aktiviteten til Drosophila ved å spore og analysere bevegelsen av fluer i en håndlaget arena ved hjelp av åpen kildekode-programvare Fiji, kompatibel med plugins for å segmentere piksler i hver ramme basert på HD-videoopptak for å beregne parametere for hastighet, avstand, etc.
Drosophila melanogaster er en ideell modellorganisme for å studere ulike sykdommer på grunn av sin overflod av avanserte genetiske manipulasjonsteknikker og ulike atferdsegenskaper. Identifisering av atferdsmangel i dyremodeller er et avgjørende mål på sykdommens alvorlighetsgrad, for eksempel i nevrodegenerative sykdommer der pasienter ofte opplever nedsatt motorisk funksjon. Men med tilgjengeligheten av ulike systemer for å spore og vurdere motoriske underskudd i fluemodeller, for eksempel narkotikabehandlede eller transgene individer, mangler det fortsatt et økonomisk og brukervennlig system for presis evaluering fra flere vinkler. En metode basert på AnimalTracker applikasjonsprogrammeringsgrensesnitt (API) er utviklet her, som er kompatibel med Fiji bildebehandlingsprogram, for systematisk å evaluere bevegelsesaktivitetene til både voksne og larveindivider fra innspilt video, og dermed muliggjøre analyse av deres sporingsadferd. Denne metoden krever bare et HD-kamera og en perifer maskinvareintegrasjon for å registrere og analysere atferd, noe som gjør det til en rimelig og effektiv tilnærming for screening av fluemodeller med transgene eller miljømessige atferdsmangler. Eksempler på atferdstester ved bruk av farmakologisk behandlede fluer er gitt for å vise hvordan teknikkene kan oppdage atferdsendringer hos både voksne fluer og larver på en svært repeterbar måte.
Drosophila melanogaster gir en utmerket modellorganisme for å undersøke cellulære og molekylære funksjoner i nevronale sykdomsmodeller opprettet av genmodifisering1, medikamentell behandling2 og senescens3. Den høye bevaringen av biologiske veier, fysiske egenskaper og sykdomsassosierte homologgener mellom mennesker og Drosophila gjør fruktfluen til en ideell etterligning fra molekylært til atferdsnivå4. I mange sykdomsmodeller er atferdsmangel en viktig indeks, og gir en nyttig modell for ulike menneskelige nevropatier 5,6. Drosophila brukes nå til å studere flere menneskelige sykdommer, nevroutvikling og nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom og amyotrofisk lateralsklerose 7,8. Påvisning av sykdomsmodellenes motoriske evne er avgjørende for å forstå den patogene utviklingen og kan gi en fenotypisk korrelasjon til de molekylære mekanismene som ligger til grunn for sykdomsprosessen.
Nylig har kommersielt tilgjengelige programvareverktøy og kostnadseffektive programmer blitt utviklet for Drosophila lokomotoriske deteksjonsstrategier, for eksempel testing med høy gjennomstrømning i grupperte fluer9,10 og måling av bevegelse i sanntid11,12. En slik konvensjonell tilnærming er rapid interactive negative geotaxis (RING), også kalt klatreanalysen, som inkluderer flere kanaler som gjør det mulig å inneholde en stor fluepopulasjon med samme kjønn og alder, noe som reduserer variasjonen mens data samlerinn 9,13. En annen pre-testing metode for å analysere lokomotorisk oppførsel er TriKinetics Drosophila aktivitet monitor (DAM), en enhet som bruker flere stråler for å oppdage fly aktivitet bevegelse i et tynt glassrør 14. Enheten registrerer posisjon kontinuerlig, noe som representerer automatisert bevegelse ved å beregne stråleovergangene for å studere aktiviteten og døgnrytmen til fluer over en lengre periode15. Selv om disse metodene har blitt mye brukt i å analysere atferdsdefekter i fruktfluer for å bestemme endringer i atferdsbevegelse, krever de alltid spesielt testutstyr eller komplekse analyseprosesser, og begrenser deres anvendelse i noen modeller med en begrenset, enkel enhet. Gruppebaserte strategier for testing av den voksne Drosophila, som FlyGrAM11 og Drosophila-øyanalysen 10, implementerer sosial rekruttering og individuell sporing i et forhåndsdefinert område. Likevel kan sosial individuell begrensning i trossede områder ha en negativ effekt på identifikasjoner i bildene, forårsaket av kollisjon eller overlapping av fluer. Selv om noen åpen kildekode-materialbaserte metoder, som TRex16, MARGO 12 og FlyPi17, har en nødsituasjon, kan de spore fluene raskt med fleksibel bruk i atferdstesting. Disse testmetodene er knyttet til forseggjorte eksperimentelle apparatinstallasjoner, spesielle programvarekrav eller profesjonelle dataspråk. For larver er måling av total tilbakelagt avstand over antall gittergrenselinjer per tidsenhet18, eller grovtelling av kroppsveggkontraksjonene for individer manuelt19, de dominerende metodene for å vurdere deres lokomotoriske evne. På grunn av mangel på presisjon i utstyr eller enheter og analysemetoder, kan noen atferdsbevegelse av larver unnslippe deteksjon, noe som gjør det vanskelig å nøyaktig vurdere atferdsbevegelse, spesielt fin bevegelse15.
Den nåværende utviklede metoden benytter AnimalTracker applikasjonsprogrammeringsgrensesnitt (API), kompatibelt med Fiji (ImageJ) bildebehandlingsprogram, for systematisk å evaluere den lokomotoriske aktiviteten til både voksne og larvefluer ved å analysere deres sporingsadferd fra HD-videoer (HD). Fiji er en åpen kildekode-programvare ImageJ-distribusjon som kan kombinere robuste programvarebiblioteker med mange skriptspråk, noe som resulterer i rask prototyping av bildebehandlingsalgoritmer, noe som gjør den populær blant biologer for sine bildeanalysemuligheter20. I den nåværende tilnærmingen utnyttes Fijis integrering i AnimalTracker API til å utvikle en unik Drosophila-atferdsanalyse med personlig algoritmeinnsetting, og gir et nyttig trinn for detaljert dokumentasjon og opplæringsprogrammer for å støtte robuste analytiske evner for lokomotorisk oppførsel (figur 1). For å omgå komplikasjonen av objektive identifikasjoner i bildene forårsaket av kollisjon eller overlapping av fluer, er hver arena begrenset til å være vert for bare en flue. Ved vurdering av sporingspresisjonen til tilnærmingen ble det implementert for å spore og kvantifisere de lokomotoriske bevegelsene til Drosophila som ble administrert med det giftige stoffet rotenon, som vanligvis brukes til dyremodeller av Parkinsons sykdom, og til slutt oppdaget bevegelsessvikt i narkotikabehandlingen21. Denne metoden, som benytter åpen kildekode og fri programvare, krever ikke høykostinstrumentering, og kan nøyaktig og reproduserbart analysere Drosophila atferdsbevegelse.
Vi har utviklet en metode, basert på open source-materialet AnimalTracker API som er kompatibelt med Fijis bildebehandlingsprogram, som kan gjøre det mulig for forskere å systematisk evaluere bevegelsesaktivitet ved å spore både voksne og individuelle larvefluer. AnimalTracke er et verktøy skrevet i Java som enkelt kan integreres i eksisterende databaser eller andre verktøy for å lette analysen av applikasjonsdesignet dyresporingsadferd24. Ved en ramme-for-ramme-analyse v…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et spesielt lanseringsfond fra Soochow University og National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). Vi takker professor Chunfeng Lius laboratoriemedlemmer for deres diskusjon og kommentarer.
Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |