यहां प्रस्तुत एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सस्ती और मजबूत विधि है जो दीर्घकालिक बायोबैंकिंग के लिए प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के अलगाव और विस्तार और वायु-तरल इंटरफ़ेस पर संस्कृति द्वारा विभेदित उपकला कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए है।
वायुमार्ग उपकला कोशिका परत फेफड़ों के ऊतकों और बाहरी वातावरण के बीच पहली बाधा बनाती है और इस प्रकार संक्रामक एजेंटों और वायु प्रदूषकों सहित साँस के पदार्थों के लगातार संपर्क में रहती है। वायुमार्ग उपकला परत तीव्र और पुरानी फेफड़ों की बीमारियों की एक बड़ी विविधता में एक केंद्रीय भूमिका निभाती है, और इस उपकला को लक्षित करने वाले विभिन्न उपचार साँस द्वारा प्रशासित किए जाते हैं। रोगजनन में एपिथेलियम की भूमिका को समझना और इसे चिकित्सा के लिए कैसे लक्षित किया जा सकता है, इसके लिए मजबूत और प्रतिनिधि मॉडल की आवश्यकता होती है। इन विट्रो एपिथेलियल कल्चर मॉडल का तेजी से उपयोग किया जा रहा है और एक नियंत्रित वातावरण में प्रयोग करने का लाभ प्रदान करता है, कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं, विषाक्त पदार्थों या संक्रामक एजेंटों को उजागर करता है। अमर या ट्यूमर सेल लाइनों के बजाय प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग का लाभ यह है कि ये कोशिकाएं सेल लाइनों की तुलना में उपकला के बेहतर प्रतिनिधित्व के साथ एक छद्मस्तरीकृत ध्रुवीकृत उपकला कोशिका परत के लिए संस्कृति में अंतर करती हैं।
यहां प्रस्तुत एक मजबूत प्रोटोकॉल है, जिसे फेफड़ों के ऊतकों से वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए पिछले दशकों में अनुकूलित किया गया है। यह प्रक्रिया वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) पर संवर्धन करके प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (पीबीईसी) के सफल अलगाव, विस्तार, संस्कृति और म्यूकोसिलरी भेदभाव की अनुमति देती है और इसमें बायोबैंकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। इसके अलावा, सेल-विशिष्ट मार्कर जीन का उपयोग करके इन संस्कृतियों के लक्षण वर्णन का वर्णन किया गया है। इन ALI-PBEC संस्कृतियों का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें पूरे सिगरेट के धुएं या भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में आना, और वायरस या बैक्टीरिया के साथ सह-संस्कृति / संक्रमण शामिल है।
इस पांडुलिपि में प्रदान किया गया प्रोटोकॉल, चरण-दर-चरण तरीके से प्रक्रिया को दर्शाता है, उन लोगों के लिए एक आधार और / या संदर्भ प्रदान करने की उम्मीद है जो अपनी प्रयोगशाला में ऐसी संस्कृति प्रणालियों को लागू करने या अनुकूलित करने में रुचि रखते हैं।
विभिन्न प्रकार के तीव्र और पुरानी फेफड़ों के रोगों में वायुमार्ग उपकला की भूमिका कोविभिन्न समीक्षाओं 1,2,3,4,5,6,7 में वर्णित किया गया है। वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की अच्छी तरह से विभेदित संस्कृतियां वायुमार्ग उपकला की भूमिका को उजागर करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं। वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृति को मोटे तौर पर वायुमार्ग बेसल उपकला कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए लागू किया जाता है और इस प्रकार विट्रो 8,9 में वायुमार्ग उपकला का विश्वसनीय रूप से अध्ययन किया जाता है। पिछले वर्षों में, कोविड-19 महामारी से संबंधित नई शोध पहलों और पशु-मुक्त अनुसंधान में विश्वव्यापी संक्रमण के परिणामस्वरूप ऐसे मॉडलों का उपयोग और भी बढ़ गया है। इसलिए, इस मॉडल सेल लाइन का बढ़ता उपयोग मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं और अनुभवों को साझा करने की आवश्यकता पर जोर देता है। यह अनुसंधान समूहों के बीच परिणामों की तुलना की भी अनुमति देगा। प्रक्रिया की मजबूती प्रमुख विशेषता है और इसलिए गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन होने की आवश्यकता है। कई प्रयोगशालाओं ने एएलआई में प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने में निवेश किया है। समय, प्रयास और आवश्यक बजट को कम किया जा सकता है जब इन प्रक्रियाओं को विस्तार से साझा किया जाता है। इन विवरणों में, उदाहरण के लिए, विभिन्न निर्माताओं द्वारा प्रदान किए गए सेल कल्चर प्लास्टिक और मीडिया की पसंद शामिल है, क्योंकि यह10,11,12 प्राप्त संस्कृतियों की विशेषताओं को प्रभावित करने के लिए पाया गया था। यह अनुभव और संस्कृति प्रक्रियाओं के विवरण साझा करने के महत्व पर जोर देता है, क्योंकि ऐसी अंतर्दृष्टि के अभाव में, परिणाम प्रभावित हो सकते हैं और / या विभिन्न प्रयोगशालाओं में सत्यापन प्रयासों में बाधा आ सकती है।
मानव फेफड़ों के उपकला में विभिन्न सेल प्रकार शामिल हैं, जिनमें बेसल कोशिकाएं, सिलिएटेड कोशिकाएं, गोब्लेट कोशिकाएं और क्लब कोशिकाएं जैसे प्रमुख प्रकार शामिल हैं। विट्रो में वायुमार्ग में उपकला कोशिका परत की मज़बूती से नकल करने के लिए, इन सेल प्रकारों को संस्कृति मॉडल में दर्शाया जाना चाहिए, और उनके ध्रुवीकरण और कार्यको 13,14,15,16 बनाए रखा गया। यह एहसास कि दाता विशेषताओं (रोग की स्थिति सहित) और कोशिकाओं की शारीरिक उत्पत्ति (यानी, नाक, श्वासनली, बड़े और छोटे वायुमार्ग) कोशिका संस्कृति की सेलुलर संरचना और कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, समान रूप से महत्वपूर्ण है। प्रासंगिक विशेषज्ञता और अभ्यास प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को सफलतापूर्वक कल्चर करने और संस्कृति की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए सहज रूप से (संस्कृति के दौरान दृश्य निरीक्षण द्वारा) और मात्रात्मक रूप से एक शर्त है। इस योगदान का उद्देश्य प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (पीबीईसी) के अलगाव और संस्कृति के लिए एक लागत और समय प्रभावी विधि प्रदान करना है जिसे श्वासनली और छोटे वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की संस्कृति पर भी लागू किया जा सकता है। ऐसी कोशिकाओं को फेफड़े के ऊतकों से अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करने के अलावा, विस्तार और बायोबैंकिंग के लिए एक विधि, और अंत में उचित लागत और समय अवधि के भीतर एक अच्छी तरह से विभेदित एएलआई-संस्कृति की स्थापना और लक्षण वर्णन के लिए प्रस्तुत और चर्चा की जाती है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के फेफड़े के ऊतकों से अलगाव का वर्णन करता है, भेदभाव क्षमता के नुकसान के बिना कोशिकाओं के इष्टतम विस्तार के लिए एक विधि, एक क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रिया, और अच्छी तरह से विभेदित एएलआई-पीबीईसी संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए एक प्रक्रिया। इसके अलावा, गुणवत्ता नियंत्रण का विवरण प्रदान किया जाता है, साथ ही विभेदित ALI-PBECs की निगरानी और मूल्यांकन के लिए निर्देश भी दिए जाते हैं।
वर्णित प्रोटोकॉल एक मैक्रोस्कोपिक रूप से सामान्य, ट्यूमर-मुक्त ब्रोन्कियल रिंग से शुरू होता है जिसे उनके फेफड़ों के कैंसर के निदान से संबंधित सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से फेफड़ों के लोब से निकाला जाता है। इसलिए यह ध्यान देने की आवश्यकता है कि इन छल्ले को सख्ती से स्वस्थ ऊतक के रूप में नहीं माना जा सकता है, जो इसलिए सेल संस्कृति विशेषताओं को प्रभावित कर सकता है। ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए वैकल्पिक स्रोतों में ब्रोन्कियल बायोप्सी, ब्रोन्कियल ब्रशिंग, या प्रत्यारोपण दाता या प्राप्तकर्ता फेफड़ों से ऊतक का उपयोग करना शामिल है। स्रोत के बावजूद, फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग करते समय, माइक्रोबियल संदूषण के जोखिम पर विचार किया जाना चाहिए, और इसलिए सेल संस्कृति के माइक्रोबियल संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए विभिन्न संस्कृति मीडिया में एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किया जाता है। विशेष रूप से, माइकोप्लाज्मा सेल कल्चर में एक उच्च और सामान्य जोखिम है, क्योंकि सेल कल्चर पर इसके व्यापक प्रकार के प्रभाव, सेल कल्चर में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध, और तथ्य यह है कि माइकोप्लाज्मा संदूषण की पुष्टि केवल माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन परख द्वारा की जा सकती है। इसलिए, फेफड़ों के ऊतकों से कोशिकाओं के अलगाव के बाद सेल कल्चर के प्रारंभिक चरण में, व्यापक स्पेक्ट्रम रोगाणुरोधी सूत्रीकरण प्रिमोसिन का उपयोग किया जाता है, और संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, यादृच्छिक रूप से चयनित नमूनों को माइकोप्लाज्मा की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया जाता है।
ब्रोन्कियल रिंग से शुरू होने वाली अलगाव प्रक्रिया भेदभाव क्षमता से समझौता किए बिना एएलआई में संस्कृतियों को शुरू करने के लिए आवश्यक इन प्राथमिक कोशिकाओं के विस्तार की डिग्री की अनुमति देने के लिए पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री प्रदान करती है। हालांकि, सीमित संख्या में कोशिकाओं के साथ पृथक उपकला कोशिकाओं का विस्तार शुरू करने से पर्याप्त कोशिकाओं के साथ पर्याप्त संख्या में आवेषण प्राप्त करने में समस्याएं हो सकती हैं जिन्हें एएलआई संस्कृति के लिए बीज दिया जा सकता है। विस्तारित संस्कृति और प्राथमिक कोशिकाओं के बार-बार पासिंग के परिणामस्वरूप प्रतिकृति शिथिलता हो सकती है। इस सीमा को दूर करने के लिए विभिन्न समाधान प्रस्तावित किए गए हैं। होरानी एट अल ने दिखाया कि रो काइनेज इनहिबिटर (रॉक) वाई -27632 ने बेसल कोशिकाओं के प्रसार में वृद्धि की 30, मौ एट अल ने विभेदित उपकला कोशिका परत 31 की विशेषताओं को बनाए रखते हुए बेसल स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए दोहरे स्मैड निषेध का उपयोग किया, और सैक्स एट अल ने एक वायुमार्ग ऑर्गेनॉइड प्रणाली विकसित की है जिसका उपयोग वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने और कई मार्गों के दौरान उनकी भेदभाव क्षमता को बनाए रखने के लिए किया जा सकता है।. बाद की विधि का उपयोग बहुत कम कोशिका संख्या वाले स्रोतों से कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए भी किया गया था, जैसे कि प्रीटरम शिशुओं (<28 सप्ताह की गर्भावस्था आयु) से श्वासनली एस्पाइरेट्स (टीए) और ब्रोन्कोएल्वोलर लैवेज (बीएएल) तरल पदार्थ, जैसाकि यहां वर्णित है। यह पाया गया कि बीएएल और टीए से अलग की गई कोशिकाओं ने एक विभेदन क्षमता दिखाई जो ब्रोन्कियल ऊतक से उत्पन्न कोशिकाओं के समान थी, हालांकि अंतर तब देखा गया जब भेदभाव नॉच सिग्नलिंग अवरोध या टीएच 2 साइटोकिन आईएल -1333 का उपयोग करके अधिक सिलिएटेड या अधिक गोब्लेट सेल युक्त संस्कृतियों की ओर झुका हुआ था। इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि यदि ALI-PBECs को समान दृष्टिकोण ों का उपयोग करके कम उपकला कोशिका संख्या ओं के साथ एक प्रारंभिक सामग्री से संवर्धित किया जाता है, तो हमेशा बुनियादी गुणवत्ता मानदंडों के लिए संस्कृतियों की जांच करें, जैसा कि प्रोटोकॉल के खंड 6 में चर्चा की गई है। महत्वपूर्ण रूप से, फीडर कोशिकाओं का उपयोग बड़ी सेल संख्या प्राप्त करने में भी मदद कर सकता है, जो प्रत्यारोपण योग्य मचान इंजीनियरिंग के लिए एक सेटिंग में आवश्यक है जहां समय और सेल संख्या आवश्यक है। यह एक अध्ययन द्वारा चित्रित किया गया है जिसमें ऑटोलॉगस उपकला कोशिकाओं को श्वासनली रोग वाले रोगी से प्राप्त बायोप्सी से संवर्धित किया गया था और कोशिकाओं को एक मुराइन भ्रूण फीडर परत (माइटोटिक रूप से निष्क्रिय 3 टी 3-जे 2 फाइब्रोब्लास्ट) और रोड / रॉक मार्ग (वाई -27632) के उपर्युक्त अवरोधक की उपस्थिति में तेजी से विस्तारित किया गया था। परिणामी सेल कल्चर को श्वासनली मचानों के पुनर्जनन के लिए उपयोगी पाया गया, और इस प्रकार इसे प्रत्यारोपण मॉडल के लिए एक उपयुक्त प्रोटोकॉल के रूप में देखा जा सकता है।
इस योगदान में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, लेकिन अन्य संस्कृति प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, अनिवार्य रूप से एक चयन पूर्वाग्रह पेश किया जाता है। यह महसूस करना महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल विवरण में अंतर, जैसे कि संस्कृतियों को शुरू करने के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की उत्पत्ति, मध्यम संरचना, और अन्य प्रोटोकॉल विवरण, संस्कृतियों की सेलुलर संरचना में परिवर्तन का कारण बन सकते हैं और इस प्रकार एएलआई संस्कृति33,35 की प्रतिक्रिया में परिवर्तन हो सकते हैं। इसके अलावा, वायुमार्ग कोशिकाओं10,11 को अलग करने के लिए विभिन्न मीडिया की तुलना करते समय सेल गुणों में अंतर भी देखा गया है। न्यूमाकल्ट और सीबीडी माध्यम की तुलना करते समय, गोब्लेट सेल और क्लब सेल एमआरएनए मार्करों, टीईआर मूल्यों और सेल परत मोटाई में अंतर देखा गया। इन टिप्पणियों के आधार पर, सांख्यिकीय आधार की कमी के बावजूद, उपयोग किए गए दाताओं की कम संख्या के कारण, मध्यम संरचना ग्राहकों के लिए अज्ञात है, और न्यूमाकल्ट माध्यम की उच्च लागत, सीबीडी माध्यम का उपयोग करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में निर्णय लिया गया था।
जैसा कि चर्चा की गई है, कोशिकाओं को शुरू में ऑर्गनॉइड कल्चर का उपयोग करके विस्तारित किया जा सकता है और बाद में 2 डी एएलआई इंसर्ट सिस्टम में स्थानांतरित किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड ्स वायुजनित पदार्थों के संपर्क में आने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जबकि एएलआई 2 डी प्रणाली का उपयोग सुसंस्कृत वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं पर सिगरेट के धुएं23,36 जैसे वायुजनित पदार्थों के प्रभाव के मूल्यांकन की अनुमति देता है। एएलआई वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक अलग दृष्टिकोण मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचआईपीएससी) 37 के भेदभाव द्वारा वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करना है। ऐसे प्रोटोकॉल में, समीपस्थ वायुमार्ग पूर्वजों के भेदभाव के बाद भेदभाव प्रोटोकॉल के अंतिम चरण में, कोशिकाओं को यहां वर्णित प्रक्रियाओं के समान प्रक्रियाओं का उपयोग करके एएलआई में कल्चर द्वारा विभेदित किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, ALI में संस्कृति के लिए cBD माध्यम का उपयोग किया जाता है। सीबीडी माध्यम एक सीरम-मुक्त माध्यम है जिसे विभिन्न पूरक ों के मिश्रण को जोड़कर तैयार किया जाता है, जो फुलचर एट अल .38 के साथ-साथ अन्य अध्ययनों से प्रेरित है। पूरक समाधान में 52 μg / mL गोजातीय पिट्यूटरी अर्क (BPE), 0.5 μg / mL हाइड्रोकार्टिसोन, 0.5 ng / mL मानव ईजीएफ, 0.5 μg / mL एपिनेफ्रीन, 10 μg / mL ट्रांसफरिन, 5 μg / mL इंसुलिन, 6.5 ng / mL ट्राइआयोडोथायरोनिन, और 0.1 ng / mL RA39 शामिल हैं। चूंकि बीपीई एक ऊतक अर्क है और बैच वार भिन्नता के अधीन है, इसलिए माध्यम को पूरी तरह से परिभाषित माध्यम नहीं माना जा सकता है, न ही यह पशु-मुक्त है। सेल कल्चर माध्यम जो पूरी तरह से परिभाषित है, बैच से बैच मतभेदों को कम करने के लिए पसंद किया जाता है। पशु-मुक्त अनुसंधान में संक्रमण को देखते हुए, यह महत्वपूर्ण है कि परिभाषित मीडिया के उत्पादन के लिए प्रयास किए जाएं जिनमें पशु उत्पाद शामिल नहीं हैं और जो वैज्ञानिक समुदाय के लिए सस्ती हैं।
अनुसंधान प्रश्न के आधार पर एएलआई मॉडल के आधार पर विभिन्न प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए जो भेदभाव प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, इसे जलमग्न संस्कृति के विभिन्न चरणों के दौरान, भेदभाव के दौरान, या अच्छी तरह से विभेदित चरण में संस्कृति में यौगिकों को जोड़कर संबोधित किया जा सकता है। ALI-PBEC संस्कृति की सेलुलर संरचना विशिष्ट यौगिकों को जोड़कर प्रभावित की जा सकती है; उदाहरण के लिए, आईएल -13 की उपस्थिति में एएलआई-पीबीईसी को अलग करने से अधिक गोब्लेट कोशिकाओं और कम सिलिएटेड कोशिकाओं के साथ एक संस्कृति उत्पन्न होती है, जबकि भेदभाव के दौरान γ-स्रावी अवरोधक डीएपीटी (नॉच सिग्नलिंग को अवरुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है) के साथ उपचार के परिणामस्वरूप गोब्लेट कोशिकाओं 23,40,41,42 की कीमत पर अधिक सिलिएटेड कोशिकाओं के साथ एक संस्कृति होती है।
इसके अलावा, कोशिकाओं को उत्तेजित करने या कुछ प्रक्रियाओं को अवरुद्ध करने के लिए एजेंटों को या तो बेसल डिब्बे पर या (बहुत कम मात्रा में) संस्कृति के एपिकल डिब्बे पर लागू किया जा सकता है। कोशिकाओं को एपिकल पक्ष से हवाई पदार्थों के संपर्क में भी लाया जा सकता है। इस तरह के एक्सपोजर डिजाइनों का उपयोग पीबीईसी 23,43,44 पर डीजल निकास या पूरे सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया है। बेसल साइड पर स्रावित प्रोटीन की निगरानी के लिए माध्यम को हर बार बदला जा सकता है; बेसल माध्यम को ताज़ा करते समय पीबीएस के साथ धोए जाने वाले कोशिकाओं के एपिकल पक्ष के लिए भी यही लागू होता है। तथाकथित एपिकल वॉश काटा जाता है और वैकल्पिक डिथियोएरिथ्रिटोल (डीटीई) को बलगम को अलग करने के लिए जोड़ा जाता है जो गोब्लेट कोशिकाओं द्वारा अधिक कुशलता से उत्पादित होता है। सेल लाइसेट को कुल प्रोटीन, आरएनए और क्रोमोसोमल और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के अलगाव के लिए प्राप्त किया जा सकता है। प्लास्टिक डालने से पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट (पीईटी) झिल्ली को काटकर और इस झिल्ली को कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलाकरने के लिए छोटे टुकड़ों में काटकर, विशिष्ट मार्करों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके कोशिकाओं का आगे अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री या एफएसीएस का उपयोग आवेषण में कोशिकाओं के ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद भी किया जा सकता है। एएलआई चरण के दौरान, सेलुलर अवरोध के विकास की निगरानी विद्युत प्रतिरोध को मापकर और बाद में टीईआर की गणना करके की जा सकती है, जहां विद्युत प्रतिरोध झिल्ली डालने के सतह क्षेत्र के व्युत्क्रमानुपाती होता है। गणना निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके ओम के नियम पर आधारित है: , जिसमें आरएम मापा विद्युत प्रतिरोध है, आरबी कोटिंग और कोशिकाओं के बिना एक सम्मिलित का आधारभूत विद्युत प्रतिरोध है, और एसए सम्मिलित की झिल्ली का सतह क्षेत्र है। चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड का उपयोग करके विद्युत प्रतिरोध को मापना सीधा है लेकिन कुएं में पेश करते समय प्रक्रियाओं को संभालने पर अत्यधिक निर्भर है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड के आकार को अपेक्षाकृत बड़े सतह क्षेत्र17 के बाधा समारोह के माप को प्रभावित करने का सुझाव दिया गया है।
सटीक ऊतक प्रतिनिधित्व बढ़ाने के उद्देश्य से एएलआई सेल कल्चर सिस्टम में और सुधार में अतिरिक्त सेल प्रकार के कोकल्चर शामिल हैं, जैसे ल्यूकोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट या एंडोथेलियल कोशिकाएं46,47,48। यह देखा गया है कि ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) या एम-सीएसएफ-विभेदित मैक्रोफेज के साथ एएलआई-पीबीईसी की सह-संस्कृति जन्मजात उपकला प्रतिक्रियाओं और मरम्मतको स्पष्ट रूप से प्रभावित करती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऐसे कोकल्चर मॉडल में, मध्यम संगतता एक मुद्दा हो सकती है। चूंकि वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृति के लिए उपयोग किया जाने वाला माध्यम विशेष रूप से पीबीईसी के लिए विकसित किया गया है और अन्य सेल प्रकारों के लिए बेहतर रूप से अनुकूल नहीं हो सकता है, इसलिए अनुकूलन आवश्यक है। वायुमार्ग जीव विज्ञान के क्षेत्र में देखी गई एक अन्य प्रकार की प्रगति जिसके लिए पृथक पीबीईसी का उपयोग किया जा सकता है, ऑर्गन्स-ऑन-चिप्स (ओओसी) तकनीक49,50 का उपयोग है। इस तकनीक का उपयोग करके, श्वास और रक्त प्रवाह की यांत्रिक शक्तियों, जैसे खिंचाव, हवा और मध्यम प्रवाह के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है।
विभिन्न दाताओं से पीबीईसी का उपयोग करते समय अंतर-दाता परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण हो सकती है, और इसलिए उपकला कोशिका संस्कृति अध्ययनों में इस परिवर्तनशीलता के लिए कई दाताओं से कोशिकाओं का उपयोग करने पर विचार करना महत्वपूर्ण है। चूंकि ALI-PBECs की संस्कृति समय लेने वाली है और काफी लागत ों से जुड़ी है, इसलिए एक सेल कल्चर इंसर्ट में विभिन्न दाताओं से कोशिकाओं को मिलाकर ALI-PBEC संस्कृतियों को स्थापित करने के विकल्प की जांच की जाती है। इस तरह, विभिन्न व्यक्तिगत दाताओं से प्राप्त संस्कृतियों की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने से पहले, प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करके पायलट प्रयोग आसानी से किए जा सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न विशेषताओं (जैसे, विभिन्न आयु वर्ग या लिंग) वाले दाताओं को एक्सप्लोरेटिव अध्ययन के लिए समूहीकृत किया जा सकता है। दाता मिश्रण का उपयोग करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न दाताओं की समान सेल संख्या मौजूद है, इस संभावना को रोकने के लिए कि एक दाता उच्च प्रसार दर के परिणामस्वरूप परिणामों पर हावी है। इसलिए, अलग-अलग दाताओं की कोशिकाओं को अलग से विस्तारित किया जाता है और एक व्यक्तिगत दाता से सीडिंग कोशिकाओं की तुलना में सम्मिलित में उच्च घनत्व पर बीज दिया जाता है, ताकि एएलआई में संक्रमण से पहले सम्मिलित में प्रसार को कम किया जा सके। सार्स-सीओवी-2 के संक्रमण कैनेटीक्स का अध्ययन करके दाता मिश्रण और संबंधित व्यक्तिगत दाताओं की प्रतिक्रियाओं की तुलना की गई। आरटी-क्यूपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का उपयोग करते हुए, यह देखा गया कि दाता मिश्रण ने उत्पादित वायरस कणों की समान संख्या औरसंक्रमित कोशिकाओं की समान संख्या दिखाकर विभिन्न व्यक्तिगत दाताओं का एक अच्छा प्रतिनिधित्व प्रदान किया।
पशु मॉडल के लिए एक स्वीकार्य विकल्प बनने के लिए, सुसंस्कृत ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का जीन संपादन संभव होनाचाहिए। एएलआई-पीबीईसी में छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) का उपयोग करके आरएनए हस्तक्षेप प्रौद्योगिकी की जांच की जाती है, हालांकि चूंकि कोशिकाओं को संस्कृति के जलमग्न चरण के दौरान सीआरएनए के साथ स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है, इसलिए लंबी संस्कृति अवधि के कारण एएलआई संस्कृति के दौरान वध को पर्याप्त रूप से बनाए नहीं रखा जाता है, जब तक कि संस्कृतिके दौरान सीआरएनए अभिकर्मक को अक्सर दोहराया न जाए।. फिर भी, जलमग्न बेसल कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए एसआईआरएनए का सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। अन्य लोगों ने राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) वितरण के साथ प्राथमिक एएलआई वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृतियों में जीन संपादन प्राप्त करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 तकनीक का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। ऐसी तकनीकों का उपयोग करते समय, यह आवश्यक है कि कोशिकाएं अपनी पूर्ण भेदभाव क्षमता बनाए रखें। क्योंकि प्राथमिक वायुमार्ग कोशिका संस्कृतियों को अनिश्चित काल तक पारित नहीं किया जा सकता है, जीन संपादित कोशिकाओं का क्लोनल विस्तार आसान नहीं है और संक्रमित कोशिकाओं का चयन करने के लिए माध्यम को जोड़ना बोझिल है। इसलिए, सभी सुसंस्कृत कोशिकाओं में वांछनीय वध प्राप्त करना मुश्किल है। नॉकआउट क्लोन उत्पन्न करने का एक विकल्प HIPSC54 में नॉक-आउट रणनीतियों का उपयोग और वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग है। एक और, यद्यपि उप-मानक, विकल्प जीन-संपादित कोशिकाओं55 का क्लोनल रूप से विस्तार करने के लिए एक अमर पीबीईसी लाइन स्थापित कर रहा है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से विभेदित स्यूडोस्ट्रेटिफाइड एएलआई-पीबीईसी उत्पन्न करने का एक तरीका है, लेकिन प्रस्तुत प्रोटोकॉल की तुलना में छोटे और बड़े अंतर के साथ ऐसी संस्कृति को स्थापित करने के लिए अन्य प्रोटोकॉल भी पाए गए हैं। हमारी राय में, संस्कृति विधियों के प्रयोगशाला सत्यापन और कड़े गुणवत्ता नियंत्रण एएलआई-पीबीईसी प्रणाली और वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की समान संस्कृति प्रणालियों के लिए आवश्यक हैं, ताकि पशु प्रयोगों के लिए एक वैध विकल्प बन सके।
The authors have nothing to disclose.
इस योगदान में वर्णित मॉडल का उपयोग करने वाले अध्ययनों को विभिन्न वित्त पोषण संगठनों द्वारा समर्थित किया गया है, जिसमें लंग फाउंडेशन नीदरलैंड, नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर हेल्थ रिसर्च एंड डेवलपमेंट (ज़ोनएमडब्ल्यू, सीओवीआईडी -19 एमकेएमडी अनुदान), डच सोसाइटी फॉर द रिप्लेसमेंट ऑफ एनिमल टेस्टिंग (स्टिचिंग प्रोएफडियरवरिज, अनुदान # 114025007), साथ ही बोहरिंगर इंगेलहेम और गैलापागोस जैसी कंपनियों से अनुसंधान अनुदान शामिल हैं। चित्र 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।
1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |