Summary

Padronização de um ensaio citométrico de esferas baseado em anticorpos contra gema de ovo

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Este protocolo descreve uma metodologia para a preparação de esferas de látex para ensaios utilizando anticorpos IgY para detecção de antígenos.

Abstract

Os imunoensaios são testes importantes para a detecção de inúmeros alvos moleculares. Dentre os métodos atualmente disponíveis, o ensaio citométrico de contas tem ganhado destaque nas últimas décadas. Cada microesfera lida pelo equipamento representa um evento de análise da capacidade de interação entre as moléculas em teste. Milhares desses eventos são lidos em um único ensaio, garantindo alta precisão e reprodutibilidade do ensaio. Essa metodologia também pode ser utilizada na validação de novos insumos, como anticorpos IgY, para o diagnóstico de doenças. Esses anticorpos são obtidos através da imunização das galinhas com o antígeno de interesse e, em seguida, da extração da imunoglobulina da gema dos ovos dos animais; Portanto, este é um método indolor e altamente produtivo para a obtenção dos anticorpos. Além de uma metodologia para a validação de alta precisão da capacidade de reconhecimento de anticorpos deste ensaio, este trabalho também apresenta um método para extração desses anticorpos, determinação das melhores condições de acoplamento para os anticorpos e esferas de látex e determinação da sensibilidade do teste.

Introduction

Dentre as técnicas de imunoensaio voltadas para o diagnóstico de doenças, o ensaio citométrico de contas tem emergido como uma abordagem altamente sensível e confiável, pois permite a análise de milhares de partículas em um único ensaio1. Essa técnica, além de apresentar alta produtividade e permitir a utilização de menores volumes de amostras, também apresenta grande flexibilidade, pois permite a detecção de diversas moléculas, como citocinas, moléculas de adesão, isotipos de anticorpos eproteínas2,3.

Diferentes partículas são utilizadas para o desenvolvimento desses ensaios, entre elas esferas de látex, que são um insumo eficaz e de baixo custo. Estas podem apresentar modificações em sua superfície, como a presença de grupos funcionais ou proteínas que permitem o acoplamento covalente ou não covalente de determinadas moléculas 3,4,5.

Esses imunoensaios usam componentes como antígenos e anticorpos para realizar a detecção de marcadores de doenças e comumente requerem anticorpos de mamíferos como camundongos, coelhos e cabras. Isso gera problemas relacionados a questões éticas, uma vez que a imunização de mamíferos geralmente requer muitos animais para obter um bom rendimento, bem como a realização frequente de procedimentos que levam ao sofrimento dos animais 6,7. Uma alternativa a isso é o uso de anticorpos IgY isolados das gemas de ovos de galinhas imunizadas, uma vez que altas concentrações dos anticorpos específicos contra os antígenos inoculados podem ser encontradas nas gemas; A produção de um frango equivale à produção de 4,3 coelhos ao longo de um ano 6,7.

Assim, o objetivo deste protocolo é fornecer um método para avaliar anticorpos IgY obtidos de gemas de ovo de galinha usando citometria de fluxo com esferas de látex. Para isso, propomos um método de padronização para um imunoensaio citométrico de esferas em formato sanduíche utilizando esferas de látex. Como modelo, foram utilizados anticorpos IgY direcionados ao antígeno II da proteína II rica em histidina do Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2). Descrevemos um método para extração dos anticorpos, discutimos os passos críticos para a definição da concentração de acoplamento destes aos cordões de látex e apresentamos uma avaliação do limite de detecção do antígeno. A alta acurácia da citometria de fluxo, aliada ao baixo custo das esferas de látex, tornam esta técnica aplicável para a análise de ferramentas de imunoensaio, como anticorpos e antígenos. Este método pode ser utilizado para a detecção de diversos alvos.

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo. 1. Extração de IgY de gemas de ovo Higienização dos ovosMergulhe os ovos (recém-postos ou até 4 dias após a colocação, da linhagem Gallus gallus Dekalb White) em uma solução diluída a 0,2% de hipoclorito de sódio, enxágue rapidamente em água corrente e limpe suavemente para uso po…

Representative Results

A Figura 2 fornece uma representação gráfica do processo de extração dos anticorpos IgY via acidificação, seguido de separação com ácido caprílico (Figura 2). Figura 2: Representação esquemática da etapa de extração dos anticorpos IgY e separaçã…

Discussion

O método de precipitação do anticorpo IgY por redução de pH seguida de separação lipídica utilizando ácido caprílico é eficiente no isolamento de anticorpos totais sem perda de funcionalidade. O método aqui proposto é mais simples e barato do que o relatado por Redwan et al.11, que também utilizaram precipitação por acidificação e ácido caprílico, porém com um protocolo mais complexo e trabalhoso. Esse método também apresenta vantagens sobre as metodologias comumente utiliza…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ao Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBIOTEC) da Universidade Federal do Amazonas (UFAM), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela concessão das bolsas. A Figura 2 e a Figura 4 foram criadas com biorender.com.

Materials

Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

References

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Cite This Article
Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

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