यहां, हम स्तनधारी कोशिकाओं से अंतर्जात ट्यूबुलिन निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें विशिष्ट संशोधन के लिए समृद्ध सूक्ष्मनलिकाएं प्राप्त करने के लिए विशिष्ट सूक्ष्मनलिकाएं-संशोधित एंजाइमों की कमी या शामिल हो सकती है। फिर हम वर्णन करते हैं कि क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए निकाले गए सूक्ष्मनलिकाएं शुद्ध सूक्ष्मनलिकाएं-बाध्यकारी प्रोटीन से कैसे सजाई जा सकती हैं।
सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं और इंट्रासेल्युलर संगठन, कोशिका विभाजन और प्रवासन में शामिल हैं। पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों के आधार पर, सूक्ष्मनलिकाएं विभिन्न अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के साथ कॉम्प्लेक्स बना सकती हैं। ये सूक्ष्मनलिका-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स अक्सर मानव रोगों में फंस जाते हैं। ऐसे परिसरों की संरचना को समझना उनकी क्रिया के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी है और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। संरचनात्मक अध्ययन के लिए ऐसे परिसरों को प्राप्त करने के लिए, विशिष्ट पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों वाले या कमी वाले सूक्ष्मनलिकाएं निकालना महत्वपूर्ण है। यहां, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित स्तनधारी कोशिकाओं से अंतर्जात ट्यूबुलिन निकालने के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन शामिल है, इसके बाद अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके अवसादन होता है। निकाले गए ट्यूबुलिन का उपयोग तब सूक्ष्मनलिकाएं के साथ क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ग्रिड तैयार करने के लिए किया जा सकता है जो रुचि के शुद्ध सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन से बंधे होते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम तीन ज्ञात ट्यूबुलिन-डिटायरोसिनिंग एंजाइमों की कमी के लिए इंजीनियर सेल लाइनों से पूरी तरह से टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं के निष्कर्षण का प्रदर्शन करते हैं। इन सूक्ष्मनलिकाएं तब क्रायो-ईएम ग्रिड पर एंजाइमेटिक रूप से निष्क्रिय सूक्ष्मनलिका-संबंधित ट्यूबुलिन डेटायरोसिनेस के साथ एक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए उपयोग की जाती हैं।
सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं; वे सेल माइग्रेशन और डिवीजन जैसे विभिन्न कार्यों में शामिल हैं, लेकिन इंट्रासेल्युलर संगठन में भी योगदान करते हैं। विभिन्न कार्यात्मक भाग्य के अनुकूल होने के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मनलिकासे जुड़े प्रोटीन (एमएपी), एंजाइम और अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत करती हैं, जिन्हें हम सामूहिक रूप से “सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन” के रूप में संदर्भित करेंगे। इन प्रोटीनों के सूक्ष्मनलिका बंधन को विभिन्न ट्यूबुलिन संशोधनों द्वारा निर्देशित किया जा सकता है, जिसे आमतौर पर “ट्यूबुलिन कोड” कहा जाता है। इस वरीयता के उदाहरण माइटोटिक सेंट्रोमियर से जुड़े किन्सिन (एमसीएके)2 और पी 1503 के डायनेन-डायनेक्टिन सीएपी-ग्लाइ डोमेन हैं, जो अधिमानतः टायरोसिनेटेड ट्यूबुलिन के साथ जुड़ते हैं, जबकि किन्सिन मोटर्स सेंट्रोमियर से जुड़े प्रोटीन ई (सीईएनपी-ई)4 और किन्सिन –2 5 ट्यूबुलिन पसंद करते हैं जिसमें सी-टर्मिनल टायरोसिन की कमी होती है।
जबकि सूक्ष्मनलिका-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों को नियोजित किया जा सकता है, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) का उपयोग अक्सर निकट-परमाणु संकल्प 6,7 पर इन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। हाल के वर्षों में, क्रायो-ईएम संरचनाओं से पता चला है कि कैसे बड़े मोटर प्रोटीन जैसे डायनेन 8,9,10 और किन्सिन11, + टीआईपी प्रोटीन जैसे ईबी 312,13 और एमसीएके 14, अन्य प्रोटीन जैसे ताऊ 15,16, और यहां तक कि छोटे अणु जैसे पैक्लिटैक्सेल, पेलोरुसाइड और ज़म्पानोलाइड 17। सूक्ष्मनलिकाएं के साथ बातचीत करें। सूक्ष्मनलिका-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं आमतौर पर पोर्सिन मस्तिष्क18 से निकाली जाती हैं। इसके बाद, क्रायो-ईएम सूक्ष्मनलिका संरचनाओं सहित अधिकांश इन विट्रो अध्ययन, पोर्सिन मस्तिष्क ट्यूबुलिन का उपयोग करके किए जाते हैं। इसलिए, इन अध्ययनों के परिणाम, ऊतकों और सेल प्रकारोंके बीच ट्यूबुलिन संशोधनों की विषम प्रकृति के महत्व को अस्पष्ट करते हैं। यह एक प्रोटीन की जांच करते समय एक विशेष समस्या पैदा करता है जिसे सूक्ष्मनलिकाएं बांधने के लिए एक विशिष्ट संशोधन की आवश्यकता होती है या पसंद होती है। इसे टाइरोसिनेटेड ट्यूबुलिन के साथ चित्रित किया जा सकता है, जो सूक्ष्मनलिका डेटायरोसिनेस मैटकैप के लिए सब्सट्रेट है।
डिटायरोसिनेशन एक ट्यूबुलिन संशोधन है जिसमें α-ट्यूबुलिन के सी-टर्मिनल अमीनो एसिड टायरोसिन की कमी होती है, जो माइटोटिक, कार्डियक और न्यूरोनल फ़ंक्शन20 से जुड़ा होता है। जबकि पूरी तरह से टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं मैटकैप के लिए आदर्श सब्सट्रेट हैं, यह इस ऊतक22,23,24,25,26 में वैसोहिबिन्स 21,22 और मैटकैप 23 डेटायरोसिनेस के कार्य के कारण पोर्सिन मस्तिष्क से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्मनलिकाएं में काफी हद तक अनुपस्थित है।. यद्यपि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हेला ट्यूबुलिन में ज्यादातर टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं होती हैं, डिटायरोसिनेशन हो सकता है, और इसलिए, ट्यूबुलिन का यह स्रोत क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए एक समान नमूना बनाने के लिए कम उपयुक्त है।
सूक्ष्मनलिकाएं के लिए मैटकैप के बंधन को प्रोत्साहित करने और संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एक सजातीय नमूना बनाने के लिए, हमने सूक्ष्मनलिकाएं के एक स्रोत की मांग की जो पूरी तरह से टायरोसिनेटेड है। इसके लिए, एक मैटकैप और वासोहिबिन-कमी वाली सेल लाइन बनाई गई थी, जिसका उपयोग पूरी तरह से टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं निकालने के लिए किया गया था। निष्कर्षण प्रक्रिया अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल पर आधारित थी जो मस्तिष्क के ऊतकों या कोशिकाओं 18,27,28,29,30 से ट्यूबुलिन निकालने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं के पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन के बार-बार चक्रों का उपयोग करती है, जिसमें ग्लिसरॉल कुशन पर केवल एक पोलीमराइजेशन चरण और सेंट्रीफ्यूजेशन होता है। एक उदाहरण के रूप में मैटकैप का उपयोग करते हुए, हम तब प्रदर्शित करते हैं कि इन सूक्ष्मनलिकाएं क्रायो-ईएम अध्ययनों के लिए कैसे उपयोग की जा सकती हैं। क्रायो-ईएम ग्रिड तैयार करने के लिए, कम नमक एकाग्रता पर दो-चरण यी अनुप्रयोग प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस पेपर के तरीके क्रायो-ईएम विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त मात्रा और शुद्धता पर अनुकूलन योग्य सूक्ष्मनलिकाएं के निष्कर्षण का वर्णन करते हैं और क्रायो-ईएम ग्रिड पर प्रोटीन-सूक्ष्मनलिका परिसर बनाने के लिए इन सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग करने के तरीके पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
यह विधि बताती है कि सेल लाइनों से अंतर्जात ट्यूबुलिन को तेजी से कैसे निकाला जाए और बाद में क्रायो-ईएम ग्रिड पर उन सूक्ष्मनलिकाएं सजाएं। सूक्ष्मनलिकाएं तापमान-संवेदनशील होती हैं। वे ठंडे वातावरण में डीपोलीमराइज्ड होते हैं औरगर्म वातावरण में पॉलीमराइजेशन करते हैं। इसलिए, ट्यूबुलिन को घुलनशील करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सोनिकेशन और क्लीयरेंस स्पिन (चरण 1.1-1.5) को निष्पादित करना महत्वपूर्ण है। यदि कोई कारक सूक्ष्मनलिकाएं इतनी अच्छी तरह से स्थिर कर रहे थे कि वे इस चरण में डिपोलीमराइज्ड नहीं होंगे, तो इन सूक्ष्मनलिकाएं और स्थिर कारकों को प्रारंभिक निकासी स्पिन के बाद गोली में छोड़ दिया जाएगा। सूक्ष्मनलिकाएं (पुनः) बहुलक बनाने के बाद, पॉलीमराइज्ड सूक्ष्मनलिकाएं युक्त समाधान को हर समय गर्म रखना महत्वपूर्ण है। हमने एचसीटी 116 कोशिकाओं से सूक्ष्मनलिकाएं निकालीं, जिनमें वीएएसएच 1, वीएएसएच 2 और मैटकैप प्रोटीन की कमी है। अन्य सेल लाइनों, साथ ही ऊतकों का उपयोग सूक्ष्मनलिकाएं निकालने के लिए किया जा सकताहै29, हालांकि दूषित पदार्थ, ट्यूबुलिन आइसोटाइप्स और उपज यहां वर्णित से बहुत अलग हो सकते हैं। प्लास्मिड को ओवरएक्सप्रेस करना जिसमें संशोधित एंजाइम होते हैं, का उपयोग विशिष्ट ट्यूबुलिन संशोधनों को पेश करने के लिए भी किया जा सकता है।
अन्य प्रोटोकॉल 18,27,28,29,30 अन्य अंतःक्रियात्मक प्रोटीनों से शून्य सूक्ष्मनलिकाएं प्राप्त करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं के पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन के कई चक्रों का उपयोग करते हैं। यहां, हमने इन प्रोटोकॉल को सरल बनाया है और केवल एक बार सूक्ष्मनलिकाएं बहुलक कीरण किया है। यह संभव है कि इस एकल पोलीमराइजेशन के कारण, ये सूक्ष्मनलिकाएं अन्य सूक्ष्मनलिकाएं-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के साथ सह-तलछट हो सकती हैं। हालांकि, हमने पाया है कि यह प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम उद्देश्यों के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध सूक्ष्मनलिकाएं देता है। यदि विशिष्ट परख के लिए एक शुद्ध नमूने की आवश्यकता होती है, तो पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन के अतिरिक्त चक्र एक शुद्ध नमूना दे सकते हैं, हालांकि यह सूक्ष्मनलिका उपज की कीमत पर हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने सूक्ष्मनलिकाएं को बहुलक बनाने के लिए पैक्लिटैक्सेल का उपयोग किया। हालांकि, पैक्लिटैक्सेल सूक्ष्मनलिका जाली को एक निश्चित मोड़ और उदय की ओर पूर्वाग्रह कर सकता है, जो रुचि के प्रोटीन के सूक्ष्मनलिका संबंध में हस्तक्षेप कर सकता है। पैक्लिटैक्सेल अनुपयुक्त होने पर अन्य सूक्ष्मनलिका-स्थिर अभिकर्मकों का उपयोग किया जा सकता है; इन अभिकर्मकों के उदाहरण गैर-टैक्सेन अणु हैं जैसे कि पेलोरुसाइड या गैर-हाइड्रोलिज़ेबल जीटीपी वेरिएंट जैसे जीएमपीसीपीपी 17,32।
संरचनात्मक रूप से प्रोटीन की जांच करने के लिए जो क्रायो-ईएम ग्रिड पर सूक्ष्मनलिकाएं बांधते हैं, किसी को सूक्ष्मनलिकाएं के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन को बांधने की आवश्यकता होती है। आमतौर पर होने वाली समस्या यह है कि प्रोटीन कॉम्प्लेक्स जो समाधान में स्थिर होते हैं, ग्रिड पर अलग हो जाते हैं। ग्रिड पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए, पहले सूक्ष्मनलिकाएं परत करना और फिर सूक्ष्मनलिका-लेपित ग्रिड में कम नमक एकाग्रता के साथ सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन को लागू करना महत्वपूर्ण था, इस प्रकार प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को सीधे ग्रिड पर इकट्ठा करना। दूसरों ने इसी तरह कम नमक वाले 33,34 प्रोटोकॉल और सफल सूक्ष्मनलिका सजावट के लिए दो-चरणीय अनुप्रयोग34,35,36 प्रोटोकॉल की सूचना दी है। यह संभावना है कि कम नमक एकाग्रता कम इलेक्ट्रोस्टैटिक चार्ज के कारण प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को अधिक स्थिर बातचीत की ओर ले जाती है। हालांकि, कम नमक सांद्रता के कारण, रुचि का प्रोटीन अवक्षेपण के लिए जोखिम में है। इसलिए, ग्रिड को विट्रीफाई करने से कुछ समय पहले तक प्रोटीन को शारीरिक रूप से प्रासंगिक नमक सांद्रता पर या उसके आसपास रखने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यह दो-चरणीय अनुप्रयोग प्रोटोकॉल संभवतः प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को ब्लोटिंग या प्लांक-फ्रीजिंग चरणों के दौरान गिरने से रोकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने Vitrobot का उपयोग किया। हालांकि, तेजी से विट्रीफिकेशन विधियों (विट्रोजेट) या ब्लोट-फ्री ग्रिड (पफलॉट) या उपकरणों का उपयोग जिनके पास दोनों गुण (गिरगिट) हैं, संभावित रूप से दो-चरणीय अनुप्रयोग को दूर कर सकते हैं, लेकिन ये वर्तमान में परीक्षण के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं।
पुनर्निर्मित क्रायो-ईएम घनत्व का अंतिम संकल्प कई कारकों से प्रभावित हो सकता है, जिसमें सूक्ष्मनलिका के सापेक्ष सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन की गति और सजावट का स्तर शामिल है जिसे प्राप्त किया जा सकता है। उच्च सूक्ष्मनलिका सजावट 3 डी घनत्व पुनर्निर्माण में प्राप्त अंतिम संकल्प के लिए फायदेमंद है। इसे कुछ कारकों द्वारा सीमित किया जा सकता है, जैसे कि सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन के शुद्धिकरण के दौरान प्राप्त उच्चतम प्रोटीन एकाग्रता, सबसे कम नमक एकाग्रता जो सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन एकत्र किए बिना सामना कर सकती है, और सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन का बाध्यकारी मोड (उदाहरण के लिए, प्रोटीन एक से अधिक ट्यूबुलिन डिमर का विस्तार कर सकता है, इस प्रकार 1: 1 बाध्यकारी अनुपात में बाधा डाल सकता है)। यद्यपि क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण के समाधान को विरल रूप से सजाए गए सूक्ष्मनलिकाएं द्वारा समझौता किया जा सकता है, कम्प्यूटेशनल विश्लेषण बहुत सारी समस्याओं को दरकिनार कर सकता है, जैसा कि हाल ही में रिपोर्ट किए गए सूक्ष्मनलिका-प्रोटीन जटिल संरचना द्वारा उदाहरण दिया गया था जिसे बेहदकम सजाया गया था।
यहां हम जिस प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, वह क्रायो-ईएम उद्देश्यों के लिए उपयुक्त सूक्ष्मनलिकाएं प्राप्त करने के लिए एक त्वरित, कम लागत वाली विधि प्रस्तुत करता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पोर्सिन मस्तिष्क ट्यूबुलिन के विपरीत, मैटकैप-कमी और वासोहिबिन-कमी वाले एचसीटी 116 कोशिकाओं से प्राप्त सूक्ष्मनलिकाएं पूरी तरह से टायरोसिनेटेड हैं (चित्रा 4)। वाणिज्यिक हेला ट्यूबुलिन, एक महंगा अभिकर्मक, सिद्धांत रूप में, अपेक्षाकृत समान रूप से टायरोसिनेटेड है और इसमें ग्लूटामाइलेशनजैसे कुछ अन्य संशोधन शामिल हैं, लेकिन बैच भिन्न हो सकते हैं, और संशोधन केवल विट्रो में प्राप्त किया जा सकता है। कस्टम-निर्मित सेल लाइनों से सूक्ष्मनलिकाएं निकालने का एक लाभ यह लचीलापन है कि सूक्ष्मनलिकाएं का अधिक सजातीय पूल बनाने के लिए ट्यूबुलिन-संशोधित एंजाइमों, जैसे ट्यूबुलिन डेटायरोसिनेस को ओवरएक्सप्रेस या हटाना पड़ता है। यह क्रायो-ईएम नमूने की सजावट और एकरूपता को लाभ पहुंचा सकता है और अंततः क्रायो-ईएम घनत्व मानचित्रों और इस नमूने से प्राप्त आणविक संरचनाओं की आसानी और गुणवत्ता को लाभान्वित करेगा।
The authors have nothing to disclose.
हम सिक्समा, ब्रुमेलकैंप और पेराकिस समूहों के सभी सदस्यों को उनकी उपयोगी वैज्ञानिक चर्चाओं और एक सुखद कामकाजी माहौल प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं, और विशेष रूप से, हम चित्रा 3 सी में चित्रित प्रोटीन एकाग्रता को निर्धारित करने में मदद करने के लिए जान सकोल्चिक (“व्यक्ति 2”) को धन्यवाद देते हैं। हम एनकेआई क्रायो-ईएम सुविधा और लीडेन विश्वविद्यालय में नीदरलैंड सेंटर फॉर इलेक्ट्रॉन नैनोस्कोपी (एनईसीईएन) को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को NWO Vici अनुदान 016.Vici.170.033 द्वारा T.R.B. को सम्मानित किया गया था। एपी और टीआरबी ऑनकोड जांचकर्ता हैं और एनडब्ल्यूओ ईएनडब्ल्यू (ओसीईएनडब्ल्यू) से धन प्राप्त करते हैं। एलएल को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ जेबी 4448-बी) से धन प्राप्त हुआ। इस शोध को डच कैंसर सोसाइटी और डच स्वास्थ्य, कल्याण और खेल मंत्रालय के संस्थागत अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Material | |||
0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
Equipment | |||
Flow hood | cell culture | ||
GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
Water bath | cell culture |