Method Article

폐 상피-중간엽 전이를 촉진하기 위해 실리카 노출 마우스 모델에서 니코틴 사용

DOI:

10.3791/65127

⸱

March 3rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 실험용 규폐증 마우스에서 니코틴이 폐섬유증 진행에 미치는 시너지 효과를 연구하기 위한 마우스 모델을 설명한다. 이중 노출 마우스 모델은 니코틴과 실리카에 동시에 노출된 후 폐의 병리학적 진행을 시뮬레이션합니다. 설명된 방법은 간단하고 재현성이 높습니다.

Abstract

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흡연과 실리카에 대한 노출은 직업 근로자들 사이에서 흔하며 실리카는 비흡연자보다 흡연자의 폐를 손상시킬 가능성이 더 높습니다. 담배의 주요 중독 성분인 니코틴이 규폐증 발병에 미치는 역할은 불분명하다. 본 연구에 사용된 마우스 모델은 간단하고 쉽게 제어할 수 있었으며, 인간의 상피-중간엽 전이를 통해 만성 니코틴 섭취 및 실리카 반복 노출이 폐 섬유증에 미치는 영향을 효과적으로 시뮬레이션했습니다. 또한 이 모델은 담배 연기에서 다른 성분의 영향을 피하면서 규폐증에 대한 니코틴의 영향을 직접 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

환경 적응 후, 생쥐에게 0.25mg/kg의 니코틴 용액을 40일 동안 매일 아침과 저녁에 12시간 간격으로 목 위의 느슨한 피부에 피하 주사했습니다. 또한, 결정질 실리카 분말(1-5μm)을 생리식염수에 현탁시키고, 20mg/mL의 현탁액으로 희석하고, 초음파 수조를 사용하여 고르게 분산시켰다. 이소플루란에 마취된 마우스는 코를 통해 이 실리카 분진 현탁액 50μL를 흡입하고 가슴 마사지를 통해 깨어났습니다. 실리카 노출은 5-19일에 매일 투여되었습니다.

이중 노출된 마우스 모델은 니코틴에 노출된 다음 실리카에 노출되었는데, 이는 두 유해 요인에 모두 노출된 작업자의 노출 이력과 일치합니다. 또한 니코틴은 마우스에서 상피-중간엽 변환(EMT)을 통해 폐섬유증을 촉진했습니다. 이 동물 모델은 규폐증 발병에 대한 여러 요인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

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작업자의 실리카 노출은 일부 직업 환경에서 불가피하며, 실리카에 노출되면 환경에서 제거된 후에도 열화가 진행됩니다. 또한 이러한 근로자의 대부분은 담배를 피우며 전통적인 담배에는 수천 가지 화학 물질이 포함되어 있으며 주요 중독 성분은 니코틴입니다 1. 전자담배는 젊은 연령층에서 점점 더 인기를 얻고 있다2; 이러한 전자담배는 니코틴 전달 시스템 역할을 하며 니코틴 접근성을 높여 폐 감수성과 폐렴을 증가시킨다3. 담배 연기는 또한 블레오마이신에 노출된 마우스에서 폐섬유증을가속화하고4 실리카에 노출된 마우스에서 폐독성 및 섬유화를 증가시킨다 5,6. 그러나 니코틴이 실리카로 인한 염증 및 폐 섬유화 과정에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 아직 조사되지 않았습니다.

기관으로 고용량의 실리카를 한 번 흡입하여 확립된 규폐증 마우스 모델은 마우스에게 외상을 입힙니다. 이 방법은 규폐증 모델을 빠르게 제공하지만, 작업자가 실리카에 반복적으로 노출되는 환경의 현실과 일치하지 않습니다....

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Protocol

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모든 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(NRC 제8판)에서 발행한 지침에 따라 수행되었으며 안후이성과학기술대학 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물 준비

  1. 32 마리의 수컷 C57 / BL6 마우스를 12 시간의 밝음 / 어두움주기가있는 실험실에서 8 주 동안 숙성했습니다. 쥐가 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는지 확인하십시오.
  2. 환경에 적응한 지 2주 후, 10주 된 쥐의 무게가 23-26g일 때 컴퓨터에서 생성된 난수를 사용하여 동물을 분할하지 않고 무작위로 그룹화하여 대조군(Con), 니코틴기(Nic), 실리카기(SiO2) 및 실리카기와 결합된 니코틴(Nic+SiO2).

2. 니코틴 준비

참고: 니코틴 밀도는 1.01g/mL입니다.

  1. 니코틴을 무수 에탄올에 녹이고 20배 희석하여 50mg/mL의 니코틴 원액을 제조합니다.
  2. 니코틴 원액을 멸균 생리식염수로 1,000배 희석하여 0....

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Results

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생쥐의 규폐증 진행에서 니코틴의 잠재적 역할을 조사하기 위해 실리카 노출과 결합된 니코틴을 연구하기 위한 마우스 모델이 확립되었습니다. 그림 1 은 니코틴 주입과 실리카 현탁액의 비강 점안을 결합한 이중 노출 마우스 모델을 사용하기 위한 실험 절차를 보여줍니다. 각 그룹에서 마우스의 병리학적 변화는 HE 염색을 사용하여 관찰되었습니다. 실리카와 결합된 니코틴에 노출된 쥐는 니코틴이나 실리카만 노출된 쥐보다 훨씬 더 심각한 폐 손상을 입었습니다. 림프구는 니코틴에 노출된 쥐의 폐에 있는 림프관 근처에서 증가하여 염증성 세포 클러스터를 형성했습니다. Masson 염색은 다른 그룹의 폐에 비해 실리카와 결합된 니코틴에 노출된 폐에서 콜라겐 섬유 침착이 크게 증가한 것으로 나타났으며, 이는 Masson 염색 정량화에 의해 뒷받침되었습니다(그림 2). 실리카에 노출된 마우스에서 폐포 구조가 파괴되고 대식세포의 수가 증가했습니다. 그.......

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Discussion

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이중 노출 동물 모델은 니코틴과 결정질 이산화규소에 대한 동시 노출의 역할과 잠재적 메커니즘을 조사하는 데 필요합니다. 이 모델은 니코틴의 피하 주사와 실리카의 비강 점적을 통해이 연구에서 달성되었습니다. 성공적인 니코틴 주입을 보장하려면 목 뒤의 피부를 잡는 것이 고통스러울 수 있으므로 작업자는 쥐를 잡는 데 익숙해져야 합니다. 따라서 쥐가 잡는 것에 점차적으로 적응하도록 하는 것이 중요합니다. 또한 생쥐의 실리카 노출에서 중요한 단계는 비강 점적입니다. 시술의 성공률과 생쥐의 생존율을 높이기 위해서는 사전에 비강 점액을 연습하는 것이 필수적입니다.

주사를 수행할 때 주사기를 쥐의 머리 위로 훑어내어 쥐가 주사기를 볼 때 강한 몸부림을 피해야 합니다. 오른손으로 쥐의 꼬리를 단단히 잡고 왼손으로 목 뒤의 귀 가장자리까지 피부를 조심스럽게 부드럽게 밀어 올려 피부를 꼬집어야 합니다. 오른손으로 쥐의 꼬리를 놓은 후 꼬리와 뒷다리는 왼손 엄지와 약지를 사용하여 안정시켜 물지 않도록.......

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Disclosures

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모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 안후이성 대학 시너지 혁신 프로그램(GXXT-2021-077)과 안후이 과학기술 대학 대학원 혁신 기금(2021CX2120)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% 포르말린 중립 정착제Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.
알코올 소독제Xintai Kanyuan 소독 제품 유한
BSA, 분획 VBeyotime 생명 공학ST023-200g
CD206 단클론 항체Proteintech60143-1-IG
구연산염 항원 검색 솔루션biosharp 생명 과학BL619A
디메틸 벤젠West Asia Chemical Technology (Shandong) Co
Enhanced BCA 단백질 분석 키트Beyotime BiotechnologyP0009
GAPDH 다클론 항체Proteintech10494-1-AP
헤마톡실린 및 에오신(H& E)Beyotime BiotechnologyC0105S
HRP 기질Millipore CorporationP90720
HRP 활용 Affinipure 염소 안티 마우스 IgG (H + L)ProteintechSA00001-1
HRP 활용 Affinipure 염소 안티 토끼 IgG (H + L)ProteintechSA00001-2
ImmPACT [R] DAB EqV Peroxidase (HRP) 기질벡터 연구소SK-4103-100
Masson의 트리크롬 염색 키트SolarbioG1340
메탄올맥클린
니코틴시그마N-3876
인산 완충 식염수 (PBS) BiosharpBL601A
생리식염수 화이난 시
PMSFBeyotime BiotechnologicalST505
양성 형광 현미경OlympusCorporationBX53+DP74
사전 염색 색상 단백질 분자량  마커 또는 사전 stained color protein ladderBeyotime BiotechnologyP0071
PVDF 멤브레인Millipore3010040001
RIPA 용해 버퍼Beyotime BiotechnologyP0013B
SDS-PAGE 젤 준비 키트Beyotime BiotechnologyP0012A
이산화규소 시그마#BCBV6865
TGF- &베타;Biossbs-0086R
Vimentin 다클론 항체Proteintech10366-1-AP
재료/장비 이름회사카탈로그 번호
0.5 mL 튜브BiosharpBS-05-M
진동 온도 조절 금속 수조Abson
파라핀 임베딩 머신정밀도 (Changzhou) 의학 기기 Co.PBM-A
파라핀 슬라이서진화 Kratai Instruments Co.
피펫Eppendorf
편광 현미경OlympusBX51
정밀 저울AcculabALC-110.4
RODI IOT 지능형 다기능 정수 시스템RSJRODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D 셰이커Scilogex
소형 동물 마취 기계Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.ZL-04A
유니버설 피펫 팁KIRGENKG1011
유니버설 피펫 팁KIRGENKG1212
유니버설 피펫 팁KIRGENKG1313
Vortex  믹서 VWR
재료/장비명
Adobe Illustrator
ImageJ
Photoshop
Prism7.0
의 첫 번째 인민 병원

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
  2. Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open.

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Nicotine ExposureSilica Mouse ModelLung FibrosisEpithelial Mesenchymal TransitionPulmonary FibrosisSubcutaneous InjectionNasal Silica ExposureImmunohistochemical StainingCollagen DepositionTGF Beta One

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