이 프로토콜은 유세포 분석 및 카운팅 비드를 사용하여 에티듐 브로마이드로 표지된 박테리아 포자를 정량화하는 데 중점을 둡니다. 이 방법은 또한 온전한 포자의 표면에서 단백질의 공유 결합을 분석하는 데 효율적입니다.
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이 논문에서
요약
초록
Bacillus subtilis의 포자는 이미 다른 생명 공학 및 면역 학적 응용 분야에 대해 제안되었습니다. 그러나 포자 표면에 고정된 항원의 검출과 정량화를 개선하는 방법론의 개발이 점점 더 필요해지고 있습니다. 유세포 분석 기반 분석은 이전에 B. subtilis의 표지된 세포를 검출하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있으며 특이적인 접근법으로 제안되었습니다. 여기에서, 우리는 유세포 분석의 사용을 사용하여 포자 표면에 형광 항체(FA)의 표시 효율을 평가하고 계수 비드를 사용하여 포자 수를 정량화할 것을 제안합니다.
이를 위해 에티듐 브로마이드를 DNA 마커로 사용하고 포자에 결합된 알로피코시아닌(APC) 표지 항체를 표면 마커로 사용했습니다. 포자의 정량화는 이 기술이 세포 검출에서 높은 정확도를 보여주기 때문에 계수 비드를 사용하여 수행되었습니다. 표지된 포자는 유세포 분석기를 사용하여 분석되었으며, 이는 결합을 확인했습니다. 그 결과, DNA 라벨링이 발아된 포자의 검출을 위해 유세포 분석에 의한 정량화의 정확도를 향상시킨다는 것이 입증되었습니다. 에티듐 브로마이드는 휴면 포자를 라벨링 할 수 없다는 것이 관찰되었습니다. 그러나, 이 기술은 그들의 표면에 결합된 형광 단백질을 가진 포자의 수의 더 정확한 결심을 제공해, 따라서 다른 신청에 있는 생물공학 플랫폼으로 포자의 사용에 집중하는 학문의 발달에서 돕습니다.
서론
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 막대 모양의 그람 양성 박테리아로, 환경 조건이 세포 성장을 허용하지 않을 때 정지된 포자를 생성할 수 있습니다1. 포자는 매우 안정적인 세포 형태이며 B. subtilis를 포함한 여러 종의 포자는 인간 및 동물용 프로바이오틱스로 널리 사용됩니다2. 내성 및 안전성 특성으로 인해 이종 단백질을 표시하는 B. subtilis의 포자는 점막 보조제, 백신 전달 시스템 및 효소 고정 플랫폼 3,4로 제안되었습니다.
B. subtilis에서 포자를 얻으려면 특수 배양 배지를 사용하여 영양 결핍에 노출시켜야 합니다. 이러한 포자를 얻고 정제한 후에는 테스트 효율을 향상시키기 위해 정량화해야 합니다 5,6. 따라서, 얻어진 포자의 농도를 분석하기 위해 특정 방법이 적용된다. 플레이트 카운팅 및 카운팅 챔버라고도 하는 Petroff-Hauss....
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프로토콜
이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 유세포 분석 설정
- 컴퓨터에 결합된 유세포 분석기의 광학 파라미터 정렬
- Cytometer 소프트웨어에 로그인합니다.
- 소프트웨어 작업 공간에서 Cytometer | 시작하고 몇 분 정도 기다립니다 | 클린 모드 | 앉아서 액체를 섭취하십시오.
참고: 기포와 장애물은 샘플 획득 전에 세포분석기 시작 과정에서 제거되었습니다.
- 품질 관리
- 품질 관리 시약을 사용하여 광전자 증배관의 전압을 조정하고 감도를 평가합니다.
- 폴리스티렌 튜브에 품질 관리 시약을 준비합니다.
- 기준선을 정의하기 위해 0.5mL의 희석제(10mM 여과 PBS, pH 7)와 3방울의 비드를 라벨링된 튜브에 추가하여 현탁 비드를 준비합니다.
- 비드 바이알을 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
- 소프트웨어 작업 공간에서 Cytometer | CST
- 품질 관리 시약을 사용하여 광전자 증배관의 전압을 조정하고 감도를 평가합니다.
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결과
오토클레이브 포자(AS) 샘플에서 2 × 103 포자/μl 및 1 × 103 포자/μl는 각각 카운팅 비드와 Petroff-Hausser 방법을 사용하여 검출되었습니다(그림 2).
그림 1: 포자의 일반적인 정량화 계획. (A) EtBr로 표지된 포자 및 (B) 이중 표지된 포자. 약어: EDC = 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드; NHS = N-하이드록시설포숙신이미드.
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토론
콜로니의 플레이트 카운팅과 같은 전통적인 방법은 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 생존 가능한 세포가 필요하며 비활성화된 포자의 정량화를 허용하지 않는다5. Petroff-Hausser 챔버는 대체 방법론이지만 이를 수행하려면 숙련된 현미경 전문가가 필요합니다. 유세포 분석은 이러한 목적을 위한 유용한 대안임이 입증되었습니다.
Genovese et al.12 는 두 개의 핵산 마커를 사용하여 Bacillus sp.의 생존 세포 및 포자를 정량화하기 위한 유세포 분석의 사용과 구성할 수치량을 결정하는 옵션을 제공하는 장비의 유속(부피/분)의 높은 제어 용량을 설명했습니다. 모든 유세포 분석 장비가 유속(부피/분)을 엄격하게 제어하는 것은 아니며 일부는 최소, 중간 및 최대 옵션으로만 조정할 수 있습니다. 이러한 경우 계수 비드를 사용하여 세포 계수의 정확성과 다른 유세포 분석 장비에 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001에 의해 부분적으로 재정 지원을 받았습니다. Governo do Estado do Amazonas, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM의 리소스; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). 저자들은 시설 사용에 대해 보건 도구 기술 개발 프로그램 PDTIS-FIOCRUZ에 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (N-하이드록시숙신이미드) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| 항인간 형광 항체 | BioLegend | 501410 | APC 항인간 IL-10 |
| 항마우스 형광 항체 | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | 유세포분석기 | ||
| BD FACSDiva 세포분석기 설정 및 추적 비드 키트(BD FACSDiva 소프트웨어 v 6.x와 함께 사용) | BD | 642412 | 품질 관리 시약 |
| BD FACSDiva 소프트웨어 v. 6.1.3 | BD | 643629 | 소프트웨어 |
| 원심분리기 MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| 카운팅 비드 | BD | 340334 | TruCount 튜브 |
| Eclipse 80i | Nikon | 형광 마이크로소프 | |
| 에티듐 브로마이드 | Ludwig Biotec | ||
| 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| 플라스틱 마이크로튜브 | Eppendorf | ||
| 폴리스티렌 튜브 | Falcon | 352008 | 5 mL 폴리스티렌 튜브, 12 x 75 mm, 뚜껑 없음, 비멸균 |
참고문헌
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
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재인쇄 및 허가
