초파리(Drosophila melanogaster)는 생물학 및 독성 연구에 널리 사용됩니다. 파리의 유용성을 확장하기 위해 우리는 여러 파리 샘플을 휘발성 전신 마취제(VGA)에 동시에 노출시키는 기기인 직렬 마취 어레이를 개발하여 VGA의 부수적 효과(독성 및 보호)를 조사할 수 있도록 했습니다.
휘발성 전신 마취제(VGA)는 전 세계적으로 모든 연령과 질병의 수백만 명의 사람들에게 사용됩니다. 고농도의 VGA(수백 마이크로몰에서 낮은 밀리몰)는 관찰자에게 “마취”로 나타나는 뇌 기능의 심오하고 비생리적인 억제를 달성하는 데 필요합니다. 이러한 고농도의 친유성 제제에 의해 유발되는 부수적 효과의 전체 스펙트럼은 알려져 있지 않지만 생물학적 중요성은 이해되지 않았지만 면역 염증 시스템과의 상호 작용이 주목되었습니다.
동물에서 VGA의 생물학적 효과를 조사하기 위해 우리는 초파리(Drosophila melanogaster)가 제공하는 실험적 이점을 활용하기 위해 SAA(Serial Anesthesia Array)라는 시스템을 개발했습니다. SAA는 직렬로 배열되고 공통 유입에 연결된 8개의 챔버로 구성됩니다. 일부 부품은 실험실에서 사용할 수 있으며 다른 부품은 쉽게 제작하거나 구입할 수 있습니다. VGA의 보정된 관리에 필요한 기화기는 상업적으로 제조된 유일한 구성 요소입니다. VGA는 대량(일반적으로 95% 이상)이 운반 가스이기 때문에 작동 중에 SAA를 통해 흐르는 대기의 작은 비율만을 구성합니다. 기본 운송업체는 항공입니다. 그러나 산소 및 기타 가스는 조사할 수 있습니다.
이전 시스템에 비해 SAA의 주요 이점은 여러 파리 코호트를 정확히 적정 가능한 용량의 VGA에 동시에 노출시킬 수 있다는 것입니다. 모든 챔버에서 몇 분 안에 동일한 농도의 VGA가 달성되므로 구별할 수 없는 실험 조건을 제공합니다. 각 챔버는 단일 파리에서 수백 마리의 파리까지 포함 할 수 있습니다. 예를 들어, SAA는 8개의 서로 다른 유전자형 또는 서로 다른 생물학적 변수(예: 남성 대 여성, 노인 대 젊은이)를 가진 4개의 유전자형을 동시에 검사할 수 있습니다. 우리는 SAA를 사용하여 신경염증-미토콘드리아 돌연변이 및 외상성 뇌 손상(TBI)과 관련된 두 가지 실험 파리 모델에서 VGA의 약력학 및 약리유전학적 상호작용을 조사했습니다.
부수적 마취 효과(즉, 즉시 관찰할 수는 없지만 행동 결과를 지연시킬 수 있는 효과)의 존재는 일반적으로 받아들여지지만, 그 메커니즘과 위험 요인에 대한 이해는 여전히 초보적이다 1,2. 그들의 지연된 발현과 미묘함은 합리적인 시간 내에 수용 가능한 비용으로 포유류 모델에서 조사할 수 있는 잠재적으로 중요한 변수의 수를 제한합니다. 초파리(Drosophila melanogaster)는 신경퇴행성 질환3과 독성학적 스크리닝4의 맥락에서 독특한 이점을 제공하는데, 이는 현재까지 마취 부수적 효과에 대한 연구에 적용되지 않았다.
우리는 마취 약력학 및 약리유전학 연구에서 초파리의 사용을 용이하게 하기 위해 SAA(Serial Anesthesia Array)를 개발했습니다. SAA의 주요 장점은 여러 코호트의 동일한 실험 조건에 동시에 노출된다는 것입니다. 초파리의 실험적 유연성과 함께 SAA의 높은 처리량을 통해 포유류 모델에서는 불가능한 규모로 생물학적 및 환경적 변수를 탐색할 수 있습니다.
원칙적으로 SAA는 운반 가스가 휘발성 물질을 전달하는 일련의 연결된 마취 위치(50mL 바이알로 만들어진 챔버)입니다. 시스템의 첫 번째 챔버에는 운반 가스가 가습되는 증류수가 포함되어 있으며(파리는 탈수에 민감함) 시스템을 통과하는 가스 흐름을 나타내는 간단한 흐름 표시기로 끝납니다. 연결 튜브의 개구부에 놓인 미세한 그물은 챔버 사이의 파리의 이동을 방지하기 위해 챔버를 분리합니다. “직렬”위치의 수는 가압되지 않은 가스 흐름 (튜브, 그물)에 대한 저항에 의해 제한됩니다.
우리는 이전 간행물5에서 이 SAA 프로토타입의 동역학을 특성화했습니다. 정확한 약동학적 특성은 SAA마다 다르지만 실험적으로 테스트된 관련 기본 사항은 다음과 같습니다: (i) 1.5-2L/min의 초기 유량은 모든 챔버(총 부피 ±550mL)를 2분 이내에 원하는 마취 농도와 평형을 이룹니다. (ii) 챔버로 전달된 마취 증기의 농도가 첫 번째 및 마지막 위치 사이에서 눈에 띄게 변하지 않는 경우, 개별 챔버 내의 기체 부피(50mL)에 포함된 마취제의 양이 임의의 수의 파리에 의해 흡수되는 양을 훨씬 초과하기 때문에; (iii) 챔버가 평형을 이루면 운반 가스 흐름을 줄여 (50-100 mL / min 이하) 환경의 낭비 및 오염을 방지 할 수 있습니다 (휘발성 마취제는 온실 가스 특성을 가짐). 증기의 정상 상태 농도를 유지하는 데 필요한 최소 유량은 파리에 의한 증기 흡수가 무시할 수 있기 때문에 주로 SAA의 누출에 달려 있습니다. 이러한 표준 조건(2% 이소플루란 및 1.5L/분 운반 가스 흐름)에서 파리는 3-4분 이내에 어레이의 모든 위치에서 마취(즉, 움직이지 않음)되며 위치 간에 눈에 띄지 않는 차이가 있습니다. VGA는 몇 분에서 몇 시간 동안 투여할 수 있으며 일반적인 노출 패러다임은 15분에서 2시간 사이입니다. 시스템을 세척하기 위해 기화기를 끄고 유량을 유지하여 어레이의 약 10배 부피(5분 동안 1.5L/min)를 교환합니다. 마취 제거 속도는 설정된 유량에 따라 달라집니다.
휘발성 마취제는 면역 염증 시스템을 포함하여 아직 확인되지 않은 수많은 표적과 상호 작용합니다6. 1차 대 부수적 결과(“마취 상태” 대 장단기 “부작용”)에 대한 개별 분자 표적의 기여도는 잘 알려져 있지 않습니다. 그러므로, 민감하고 처리량이 높은 파리 시스템은 파리와 포유류 사이의 명백한 차이에도 불구하고 고등 동물에서의 실험에 정보를 제공하는 데 유용하다7. 실제로 몇 가지 차이점이 유리할 수 있습니다. 예를 들어, 파리의 면역체계는 반응의 적응 팔이 없다는 점에서 고등 동물의 면역체계와 다르다8. 이것은 인간의 질병을 이해하는 데 한계가 있는 것처럼 보일 수 있지만, 적응 반응과 분리하여 VGA와 선천성 면역-염증 반응의 상호작용을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공한다9. 이를 통해 VGA가 염증에 미치는 약리학적 효과와 집단에 존재하는 다양한 유전적 배경에 의한 조절에 대한 연구를 할 수 있습니다.
SAA 구성의 중요한 단계에는 마취 가스 혼합물의 누출을 방지하기 위해 단단한 피팅을 보장하는 것이 포함됩니다. SAA는 실험실 공간의 오염을 방지하기 위해 흄 후드에 보관해야 합니다. 캐리어 가스 실린더에서 SAA 다운스트림의 유량 표시기까지의 모든 요소는 체크리스트에 설명된 대로 점검해야 합니다.
파리에 VGA를 투여하는 다른 방법들은 작동이 복잡하고(이뇌계)21 처리량이 낮고22, 여러 개체군이 동시에 노출되는 것을 허용하지 않으며23, 마취 농도를 정밀하게 조절할 수 없거나21, 임상적으로 인정되는 용어로 번역하기 어려운 판독값을 가지고 있다24.
SAA의 현재 버전은 상업용 기화기에 의존하므로 독성 연구는 휘발성 마취제로 제한됩니다. 다른 휘발성 물질과 함께 사용하는 경우 출력을 보정한 후 기화기를 “오프 라벨”로 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 휘발성 물질을 기화시키는 다른 방법이 적용될 수 있으며, 이는 이전에 설명한 바와 같이 약물 농도를 적정하기 위한 전용 측정을 필요로 한다25.
유량 표시기 외에는 경보가 없습니다(즉, 탱크가 비어 있으면 SAA를 통한 흐름이 중단됨). 사용 강도에 따라 SAA는 Tygon 튜브를 청소, 조이고 교체해야 할 수도 있습니다. 우리는 7년 동안 원래 SAA에 대해 “유지 보수”를 두 번 수행했습니다.
초파리를 마취하는 이 방법을 사용하면 고처리량 시스템에서 초파리 연구원이 사용할 수 있는 유전 도구 상자를 사용할 수 있습니다. 상이한 집단(예를 들어, 유전자형, 연령, 성별)의 파리의 여러 코호트는 동일한 마취 농도 및 당면한 연구 문제에 적합한 운반 가스(공기,O2,N2O, 비활성 기체)의 원하는 조합에 동시에 노출될 수 있다.
여기에서 우리는 SAA가 ND2360114 플라이 라인에서 이소플루란 독성에 대한 회복력의 예상치 못한 변화를 밝히는 데 유용했으며 표준 실험실 플라이 라인이 AP에 대한 반응성이 다르다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과를 식별하는 것은 실험 조건의 엄격한 제어와 SAA의 높은 처리량 덕분에 가능했습니다.
SAA는 곤충(예: 꿀벌)에 대한 다른 휘발성 유기 화합물(VOC)의 영향을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 휘발성 마취제(이소플루란: 20°C에서 240mmHg)에 가까운 증기압을 가진 VOC의 경우 기존 기화기를 사용할 수 있지만 출력을 보정해야 합니다. 데스플루란을 위한 상업용 기화기는 가열되어 잠재적으로 추가적인 유연성을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
SAA 프로토타입 제작에 대해 위스콘신-매디슨 대학교 마취과 피어스 연구소의 Mark G. Perkins에게 감사드립니다. 이 연구는 R01GM134107을 사용하는 NIGMS (National Institute of General Medical Sciences)와 위스콘신 – 매디슨 대학교 (University of Wisconsin-Madison)의 마취과의 R & D 기금에 의해 지원됩니다.
Serial Anesthesia Array: | |||
5 mL Serological Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10C | Polystyrene, 5mL serological pipette |
50 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 1495949A | Polypropylene, 50 mL |
Cable Tie Mounting Pad | Grainger | 6EEE6 | 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H |
Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
Fabric Mesh Netting | 1 mm mesh | ||
Flow Indicator | Grainger | 8RH52 | 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style |
Tygon Tubing | Tygon | E-3603 | ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16 |
Wood Frame | 10 feet of 2 inch x 3/4 inch | ||
Zip Tie | >5inch | ||
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold): | |||
Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
Commercial Manifold and Vaporizers: | |||
1/4 inch Equal Barbed Y Connector | Somni Scientific | BF-9000 | |
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) | Somni Scientific | BF-9004 | |
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob | Somni Scientific | FP-4002 | |
Flowmeter auxiliary mounting bracket | Somni Scientific | NonInvPart | |
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male | Somni Scientific | GF-11012 | |
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) | Somni Scientific | TT-17000 | |
Tec 7 Isoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9101-000 | Agent-specific vaporizer (Isoflurane) |
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9301-000 | Agent-specific vaporizer (Sevoflurane) |