Automatisation du traitement des bourgeons d’agrumes pour la détection des agents pathogènes en aval grâce à l’ingénierie des instruments
Summary
Nous avons conçu, fabriqué et validé un instrument qui traite rapidement les tissus de bourgeons d’agrumes riches en phloème. Par rapport aux méthodes actuelles, l’extracteur de tissus de bourgeons (BTE) a permis d’augmenter le débit d’échantillons et de réduire les coûts de main-d’œuvre et d’équipement requis.
Abstract
Les agents pathogènes des agrumes transmissibles par les greffons et limités par le phloème, tels que les virus, les viroïdes et les bactéries, sont responsables d’épidémies dévastatrices et de graves pertes économiques dans le monde entier. Par exemple, le virus de la tristeza des agrumes a tué plus de 100 millions d’agrumes dans le monde, tandis que « Candidatus Liberibacter asiaticus » a coûté 9 milliards de dollars à la Floride. L’utilisation de bourgeons d’agrumes testés pour la propagation des arbres est essentielle pour la gestion de ces agents pathogènes. Le programme de protection clonale des agrumes (CCPP) de l’Université de Californie à Riverside utilise des tests de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour tester des milliers d’échantillons d’arbres sources de bourgeons d’agrumes chaque année afin de protéger les agrumes de Californie et de fournir des unités de propagation propres au National Clean Plant Network. Un goulot d’étranglement important dans la détection moléculaire à haut débit des virus et des viroïdes des agrumes est l’étape de traitement des tissus végétaux.
Une bonne préparation des tissus est essentielle pour l’extraction d’acides nucléiques de qualité et l’utilisation en aval dans les tests PCR. Le hachage, le pesage, la lyophilisation, le broyage et la centrifugation des tissus végétaux à basse température pour éviter la dégradation des acides nucléiques prennent beaucoup de temps et de main-d’œuvre et nécessitent des équipements de laboratoire coûteux et spécialisés. Cet article présente la validation d’un instrument spécialisé conçu pour traiter rapidement les tissus d’écorce riches en phloème du bois de bourgeon d’agrumes, appelé extracteur de tissu de bourgeon (BTE). Le contour d’oreille augmente le débit d’échantillons de 100 % par rapport aux méthodes actuelles. De plus, cela diminue la main-d’œuvre et le coût de l’équipement. Dans ce travail, les échantillons de contours d’oreille avaient un rendement en ADN (80,25 ng/μL) comparable au protocole de hachage manuel du CCPP (77,84 ng/μL). Cet instrument et le protocole de traitement rapide des tissus végétaux peuvent bénéficier à plusieurs laboratoires et programmes de diagnostic des agrumes en Californie et devenir un système modèle pour le traitement des tissus pour d’autres cultures ligneuses vivaces dans le monde entier.
Introduction
Les agents pathogènes des agrumes limités par le phloème transmissibles par les greffons, tels que les viroïdes, les virus et les bactéries, ont provoqué des épidémies dévastatrices et de graves pertes économiques dans toutes les régions productrices d’agrumes du monde. Les viroïdes d’agrumes sont des facteurs de production limitants en raison des maladies exocortis et de cachexie qu’ils causent dans les types d’agrumes économiquement importants, tels que les hybrides trifoliés, les mandarines, les clémentines et les mandarines 1,2,3. En Californie, ces types d’agrumes sensibles aux viroïdes sont à la base du marché croissant et rentable des « éplucheurs faciles », suivant la tendance changeante de la préférence des consommateurs pour les fruits faciles à peler, segmentés et sans pépins 4,5,6. Ainsi, les viroïdes d’agrumes sont réglementés par le Département de l’alimentation et de l’agriculture de Californie (CDFA) « Programme de propreté des ravageurs du matériel de pépinière d’agrumes – Projet de loi 140 du Sénat », et les laboratoires de la Direction du diagnostic des ravageurs des plantes du CDFA effectuent des milliers de tests de viroïdes d’agrumes chaque année 7,8,9,10 . Le virus de la tristeza des agrumes (CTV) a été responsable de la mort de plus de 100 millions d’agrumes depuis le début de l’épidémie mondiale dans les années 1930 3,9,10,11. En Californie, les isolats du virus résistants à la piqûre de la tige et à la rupture trifoliée constituent une menace sérieuse pour l’industrie californienne des agrumes, dont le chiffre d’affaires s’élève à 3,6 milliards de dollars. Par conséquent, le CDFA classe le CTV comme un phytoravageur réglementé de classe A, et le laboratoire de l’Agence d’éradication de la tristeza de Californie centrale (CCTEA) effectue des enquêtes approfondies sur le terrain et des milliers de tests de dépistage du virus chaque année15,16. On estime que la bactérie « Candidatus Liberibacter asiaticus » (CLas) et la maladie du huanglongbing (HLB) ont causé près de 9 milliards de dollars de dommages économiques à la Floride en raison d’une réduction de 40 % de la superficie d’agrumes, d’une diminution de 57 % des opérations d’agrumes et d’une perte de près de 8 000 emplois17,18. En Californie, une hypothétique réduction de 20 % de la superficie d’agrumes due au HLB devrait entraîner plus de 8 200 pertes d’emplois et une réduction de plus d’un demi-milliard de dollars du produit intérieur brut de l’État. Par conséquent, le programme de prévention des ravageurs et des maladies des agrumes dépense plus de 40 millions de dollars par an pour des enquêtes visant à tester, détecter et éradiquer les CLas de Californie14,17,19,20.
Un élément clé de la lutte contre les viroïdes, les virus et les bactéries des agrumes est l’utilisation de matériaux de multiplication testés par des agents pathogènes (c.-à-d. le bois de bourgeon) pour la production d’arbres. Le bois de bourgeon d’agrumes testé contre les agents pathogènes est produit et maintenu dans le cadre de programmes de quarantaine complets qui utilisent des techniques avancées d’élimination et de détection des agents pathogènes10,21. Le programme de protection clonale des agrumes (CCPP) de l’Université de Californie à Riverside teste chaque année des milliers d’échantillons de bourgeons provenant de variétés d’agrumes nouvellement importées dans l’État et aux États-Unis, ainsi que d’arbres sources de bourgeons d’agrumes, afin de protéger les agrumes de Californie et de soutenir les fonctions du National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. Pour gérer le grand volume d’analyses d’agrumes, des tests de détection d’agents pathogènes à haut débit, fiables et rentables sont un élément fondamental pour le succès de programmes tels que le CCPP 7,10,22.
Bien que les tests de détection d’agents pathogènes moléculaires tels que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) aient permis d’augmenter considérablement le débit dans les laboratoires de diagnostic des plantes, d’après notre expérience, l’un des goulots d’étranglement les plus critiques dans la mise en œuvre de protocoles à haut débit est l’étape de traitement des échantillons de tissus végétaux. Cela est particulièrement vrai pour les agrumes, car les protocoles actuellement disponibles pour le traitement des tissus riches en phloèmes tels que les pétioles des feuilles et l’écorce des bourgeons demandent beaucoup de main-d’œuvre, prennent du temps et nécessitent des équipements de laboratoire coûteux et spécialisés. Ces protocoles nécessitent le hachage, le pesage, la lyophilisation, le broyage et la centrifugation à basse température pour éviter la dégradation des acides nucléiques 8,23,24. Par exemple, au laboratoire de diagnostic du CCPP, le traitement des échantillons comprend (i) le hachage manuel (6 à 9 échantillons/h/opérateur), (ii) la lyophilisation (16 à 24 h), (iii) la pulvérisation (30 à 60 s) et (iv) la centrifugation (1 à 2 h). Le processus nécessite également des fournitures spécialisées (p. ex., des tubes robustes à verrouillage de sécurité, des billes de broyage en acier inoxydable, des adaptateurs, des lames, des gants) et de multiples pièces d’équipement de laboratoire coûteuses (p. ex., congélateur à ultra-basse température, lyophilisateur, pulvérisateur de tissus, station de cryostation d’azote liquide, centrifugeuse réfrigérée).
Comme dans toute industrie, l’ingénierie des équipements et l’automatisation des processus sont essentielles pour réduire les coûts, augmenter le rendement et fournir des produits et des services uniformes et de haute qualité. L’industrie des agrumes a besoin d’instruments de traitement des tissus à faible coût qui nécessitent un minimum de compétences pour fonctionner et, en tant que tels, sont faciles à transférer aux laboratoires de diagnostic et aux opérations sur le terrain pour permettre une grande capacité de traitement des échantillons pour une détection rapide des agents pathogènes en aval. Technology Evolving Solutions (TES) et le CCPP ont mis au point (c.-à-d. conçu et fabriqué) et validé (c.-à-d. testé avec des échantillons d’agrumes et comparé aux procédures de laboratoire standard) un instrument peu coûteux (c.-à-d. éliminé le besoin d’équipement de laboratoire spécialisé) pour le traitement rapide des tissus d’agrumes riches en phloème (c.-à-d. le bois de bourgeon), appelé extracteur de tissus de bourgeon (BTE). Comme le montre la figure 1, le contour d’oreille comprend un composant de base pour l’alimentation et les commandes, ainsi qu’une chambre amovible pour le traitement du bois de bourgeon d’agrumes. La chambre BTE est composée d’une meule spécialement conçue pour dépouiller les tissus d’écorce riches en phloème du bourgeon d’agrumes. Le tissu d’écorce déchiqueté est éjecté rapidement par un orifice coulissant dans une seringue contenant un tampon d’extraction, filtré et préparé pour l’extraction et la purification des acides nucléiques sans aucune manipulation ou préparation supplémentaire (figure 1). Le système contour d’oreille comprend également une application de suivi des échantillons sans papier et une application de pesage intégrée, qui enregistrent les informations de traitement des échantillons dans une base de données en ligne en temps réel.
Le système BTE a augmenté la capacité de diagnostic de laboratoire du CCPP de plus de 100 % et a toujours produit des extraits de tissus d’agrumes adaptés à la purification d’acides nucléiques de haute qualité et à la détection en aval d’agents pathogènes d’agrumes transmissibles par greffe à l’aide de tests PCR. Plus précisément, le contour d’oreille a réduit le temps de traitement des tissus de plus de 24 h à ~3 minutes par échantillon, a remplacé les instruments de laboratoire coûtant plus de 60 000 $ (figure 2, étapes 2 à 4) et a permis le traitement d’échantillons de plus grande taille.
Cet article présente les données de validation du traitement des tissus d’écorce d’agrumes à haut débit du contour d’oreille, de l’extraction des acides nucléiques et de la détection des agents pathogènes avec des échantillons de bourgeons d’agrumes provenant d’arbres sources, y compris tous les contrôles positifs et négatifs appropriés de l’installation de quarantaine de Rubidoux et de l’installation de la Fondation Lindcove, respectivement. Nous présentons également les changements de débit et de temps de traitement par rapport à la procédure de laboratoire actuelle (Figure 2). De plus, ce travail fournit un protocole détaillé, étape par étape, pour les laboratoires d’analyse des agents pathogènes des agrumes et démontre comment le contour d’oreille peut soutenir les fonctions du matériel de pépinière, de l’enquête et des programmes d’éradication des agents pathogènes.
Figure 1 : Extracteur de tissus de bourgeons. Le contour d’oreille comprend un composant de base pour l’alimentation et les commandes, ainsi qu’une chambre amovible pour le traitement du bois de bourgeon d’agrumes. La chambre BTE est composée d’une meule spécialement conçue pour décaper les tissus d’écorce riches en phloème du bois de bourgeons d’agrumes. Le tissu d’écorce déchiqueté est éjecté rapidement par un orifice coulissant dans une seringue, filtré et préparé pour l’extraction et la purification des acides nucléiques sans aucune manipulation ou préparation supplémentaire. Abréviation : BTE = extracteur de tissus de bourgeons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison étape par étape entre la procédure conventionnelle de hachage manuel en laboratoire et le traitement des contours d’oreille. Le traitement des contours d’oreille implique le traitement des tissus d’écorce d’agrumes à haut débit, l’extraction des acides nucléiques et la détection des agents pathogènes. Le temps de chaque étape est indiqué entre parenthèses. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec l’avènement de la maladie HLB des agrumes, pour réduire les pertes, l’industrie des agrumes, les organismes de réglementation et les laboratoires de diagnostic ont été invités à s’appuyer sur des méthodes d’extraction d’acides nucléiques à haut débit combinées à des tests manuels de traitement des échantillons et de détection d’agents pathogènes à faible débit tels que la qPCR34 pour tester des arbres individuels, en combinaison avec des pratiques de gestion des …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le peuple Cahuilla comme les gardiens traditionnels de la terre sur laquelle les travaux expérimentaux ont été achevés. Nous sommes reconnaissants au professeur Norman Ellstrand de l’Université de Californie, Riverside, d’avoir fourni un espace de laboratoire pour mener des activités de recherche dans le cadre de ce projet dans le cadre de l’initiative UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). Cette recherche a été financée par le Programme de subventions globales pour les cultures spéciales (subvention no 18-0001-055-SC). Un soutien supplémentaire a également été fourni par le projet CRB 6100; Institut national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA, projet Hatch 1020106; et le National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) décerné à Georgios Vidalakis.
Materials
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4×12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
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