Vi konstruerte, fabrikkerte og validerte et instrument som raskt behandler floemrike bark sitrus budwood vev. Sammenlignet med dagens metoder har budwood tissue extractor (BTE) økt prøvegjennomstrømningen og redusert de nødvendige arbeids- og utstyrskostnadene.
Graft-overførbare, floem-begrensede patogener av sitrus som virus, viroider og bakterier er ansvarlige for ødeleggende epidemier og alvorlige økonomiske tap over hele verden. For eksempel drepte sitrus tristeza-viruset over 100 millioner sitrustrær globalt, mens “Candidatus Liberibacter asiaticus” har kostet Florida 9 milliarder dollar. Bruken av patogentestet sitrus budwood for forplantning av trær er nøkkelen til forvaltningen av slike patogener. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, bruker polymerasekjedereaksjonsanalyser (PCR) for å teste tusenvis av prøver fra sitrusbudwood-kildetrær hvert år for å beskytte Californias sitrus og for å gi rene forplantningsenheter til National Clean Plant Network. En alvorlig flaskehals i molekylær påvisning av sitrusvirus og viroider med høy gjennomstrømning er behandlingstrinnet for plantevev.
Riktig vevsforberedelse er avgjørende for ekstraksjon av kvalitetsnukleinsyrer og nedstrøms bruk i PCR-analyser. Hakking av plantevev, veiing, frysetørking, sliping og sentrifugering ved lave temperaturer for å unngå nukleinsyrenedbrytning er tidkrevende og arbeidskrevende og krever dyrt og spesialisert laboratorieutstyr. Dette papiret presenterer valideringen av et spesialisert instrument konstruert for raskt å behandle floemrike barkvev fra sitrus budwood, kalt budwood tissue extractor (BTE). BTE øker prøvegjennomstrømningen med 100% sammenlignet med dagens metoder. I tillegg reduserer det arbeidskraft og kostnaden for utstyr. I dette arbeidet hadde BTE-prøvene et DNA-utbytte (80,25 ng / μL) som var sammenlignbart med CCPPs håndhakkingsprotokoll (77,84 ng / μL). Dette instrumentet og den raske plantevevsbehandlingsprotokollen kan være til nytte for flere sitrusdiagnostiske laboratorier og programmer i California og bli et modellsystem for vevsbehandling for andre treaktige flerårige avlinger over hele verden.
Graft-overførbare floem-begrensede patogener av sitrus, som viroider, virus og bakterier, har forårsaket ødeleggende epidemier og alvorlige økonomiske tap i alle sitrusproduserende områder av verden. Sitrus viroider er begrensende produksjonsfaktorer på grunn av exocortis og kakeksi sykdommer de forårsaker i økonomisk viktige sitrustyper, som trifoliate, trifoliate hybrider, mandariner, klementiner og mandariner 1,2,3. I California er disse viroidfølsomme sitrustypene grunnlaget for det voksende og lønnsomme markedet for “lettskrellere”, etter den skiftende trenden i forbrukernes preferanse for frukt som er lett å skrelle, segmentert og frøfri 4,5,6. Dermed er sitrusviroider regulert under California Department of Food and Agriculture (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140”, og laboratoriene til CDFAs Plant Pest Diagnostics Branch utfører tusenvis av sitrusviroidtester årlig 7,8,9,10 . Citrus tristeza virus (CTV) har vært ansvarlig for døden av over 100 millioner sitrus trær siden begynnelsen av den globale epidemien på 1930-tallet 3,9,10,11. I California utgjør stammegrop og trifoliate bruddmotstandsisolater av viruset en alvorlig trussel mot sitrusindustrien i California på 3,6 milliarder dollar12,13,14. Følgelig klassifiserer CDFA CTV som et regulert klasse A-planteskadegjører, og laboratoriet til Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) utfører omfattende feltundersøkelser og tusenvis av virustester hvert år15,16. Bakterien “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) og huanglongbing (HLB) sykdommen anslås å ha forårsaket nær 9 milliarder dollar av økonomisk skade på Florida som følge av en 40% reduksjon av sitrus areal, en 57% reduksjon i sitrus operasjoner, og et tap på nesten 8000 arbeidsplasser17,18. I California ble en hypotetisk 20% reduksjon i sitrus areal på grunn av HLB spådd å resultere i mer enn 8,200 tap av arbeidsplasser og en reduksjon på over en halv milliard dollar i statens bruttonasjonalprodukt. Derfor bruker Citrus Pest and Disease Prevention Program over $ 40 millioner årlig på undersøkelser for å teste, oppdage og utrydde CLas fra California14,17,19,20.
Et sentralt element i forvaltningen av sitrusviroider, virus og bakterier er bruken av patogentestede forplantningsmaterialer (dvs. budwood) for treproduksjon. Patogentestet sitrusbudved produseres og vedlikeholdes innenfor omfattende karanteneprogrammer som bruker avanserte patogeneliminerings- og deteksjonsteknikker10,21. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, tester tusenvis av budwood-prøver hvert år fra sitrusvarianter som nylig er importert til staten og USA, samt kildetrær til sitrusbudwood, for å beskytte Californias sitrus og støtte funksjonene til National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. For å håndtere det store volumet av sitrustesting, er høy gjennomstrømning, pålitelige og kostnadseffektive patogendeteksjonsanalyser en grunnleggende komponent for suksessen til programmer som CCPP 7,10,22.
Mens molekylærbaserte patogendeteksjonsanalyser som polymerasekjedereaksjon (PCR) har tillatt betydelige økninger i gjennomstrømning i plantediagnostiske laboratorier, er vår erfaring at en av de mest kritiske flaskehalsene i implementeringen av protokoller med høy gjennomstrømning er behandlingstrinnet for plantevevsprøver. Dette gjelder spesielt for sitrus fordi de tilgjengelige protokollene for behandling av floemrike vev som bladbladblader og budwoodbark er arbeidskrevende, tidkrevende og krever dyrt og spesialisert laboratorieutstyr. Disse protokollene krever håndhugging, veiing, frysetørking, sliping og sentrifugering ved lave temperaturer for å unngå nukleinsyrenedbrytning 8,23,24. For eksempel, ved CCPPs diagnostiske laboratorium, inkluderer prøvebehandling (i) håndhakking (6-9 prøver/t/operatør), (ii) frysetørking (16-24 timer), (iii) pulverisering (30-60 s) og (iv) sentrifugering (1-2 timer). Prosessen krever også spesialiserte forsyninger (f.eks. kraftige safe-lock rør, rustfritt stål slipekuler, adaptere, kniver, hansker) og flere stykker kostbart laboratorieutstyr (f.eks. ultra-lav fryser, frysetørker, vevpulverisator, flytende nitrogenkryostasjon, nedkjølt sentrifuge).
Som i enhver bransje er utstyrsteknikk og automatisering av prosesser nøkkelen til å senke kostnadene, øke gjennomstrømningen og tilby ensartede produkter og tjenester av høy kvalitet. Sitrusindustrien trenger rimelige vevsbehandlingsinstrumenter som krever minimal ferdighet for å operere, og som sådan er enkle å overføre til diagnostiske laboratorier og feltoperasjoner for å tillate høy prøvebehandlingskapasitet for rask nedstrøms patogendeteksjon. Technology Evolving Solutions (TES) og CCPP utviklet (dvs. design og fabrikasjon) og validert (dvs. testet med sitrusprøver og sammenlignet med standard laboratorieprosedyrer) et billig (dvs. eliminert behovet for spesialisert laboratorieutstyr) instrument for rask behandling av floemrike sitrusvev (dvs. budwood), kalt budwood tissue extractor (BTE). Som vist i figur 1 inneholder BTE en basekomponent for strøm og kontroller, pluss et avtagbart kammer for behandling av sitrusbudved. BTE-kammeret består av et slipeskive som er spesielt designet for å fjerne floemrike barkvev fra sitrusknoppveden. Det strimlede barkvevet kastes raskt ut gjennom en glideport inn i en sprøyte som inneholder ekstraksjonsbuffer, filtreres og klargjøres for nukleinsyreekstraksjon og rensing uten ytterligere håndtering eller klargjøring (figur 1). BTE-systemet inkluderer også en papirløs prøvesporingsapplikasjon og en integrert veieapplikasjon som registrerer prøvebehandlingsinformasjonen i en online database i sanntid.
BTE-systemet har økt CCPPs laboratoriediagnostiske kapasitet med over 100% og har konsekvent produsert sitrusvevekstrakter egnet for rensing av nukleinsyrer av høy kvalitet og nedstrøms påvisning av transplantatoverførbare patogener av sitrus ved hjelp av PCR-analyser. Mer spesifikt har BTE redusert tiden for vevsbehandling fra over 24 timer til ~ 3 minutter per prøve, erstattet laboratorieinstrumenter som koster over $ 60 000 (figur 2, trinn 2-4), og tillatt behandling av større prøvestørrelser.
Dette papiret presenterer BTE høy gjennomstrømning sitrus bark vev behandling, nukleinsyre ekstraksjon, og patogen deteksjon validering data med sitrus budwood prøver fra kilde trær, inkludert alle relevante positive og negative kontroller fra CCPP Rubidoux Quarantine Facility og Lindcove Foundation Facility, henholdsvis. Vi presenterer også endringer i gjennomstrømning og behandlingstid sammenlignet med dagens laboratorieprosedyre (figur 2). I tillegg gir dette arbeidet en detaljert, trinnvis protokoll for testlaboratorier for sitruspatogener og demonstrerer hvordan BTE kan støtte funksjonene til patogen-ren barnehagelager, undersøkelse og utryddelsesprogrammer.
Figur 1: Budwood vev extractor. BTE inneholder en basekomponent for strøm og kontroller, pluss et flyttbart kammer for behandling av sitrusbudved. BTE-kammeret består av et slipeskive som er spesielt designet for å stripe det floemrike barkvevet fra sitrusknopp. Det strimlede barkvevet kastes raskt ut gjennom en glideport i en sprøyte, filtreres og gjøres klar for nukleinsyreekstraksjon og rensing uten ytterligere håndtering eller forberedelse. Forkortelse: BTE = budwood vev extractor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvis sammenligning mellom den konvensjonelle laboratorieprosedyren for håndhakking og BTE-behandling. BTE-behandling innebærer behandling av sitrusbarkvev med høy gjennomstrømning, nukleinsyreekstraksjon og patogendeteksjon. Tiden for hvert trinn er angitt i parentes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Med fremkomsten av HLB sitrussykdom, for å redusere tap, har sitrusindustrien, reguleringsorganer og diagnostiske laboratorier blitt oppfordret til å stole på nukleinsyreekstraksjonsmetoder med høy gjennomstrømning kombinert med manuell prøvebehandling med lav gjennomstrømning og patogendeteksjonsanalyser som qPCR34 for testing av individuelle trær, i kombinasjon med sykdomshåndteringspraksis35. Californias HLB-positivitetsrate har gått fra 0.01% i 2012 til 1.2% i…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Cahuilla-folket som de tradisjonelle vokterne av landet der det eksperimentelle arbeidet ble fullført. Vi er takknemlige for professor Norman Ellstrand ved University of California, Riverside, for å gi laboratorieplass til å utføre forskningsaktiviteter for dette prosjektet under UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Denne forskningen ble støttet av CDFA – Specialty Crop Block Grant Program (stipend nr. 18-0001-055-SC). Ytterligere støtte ble også gitt av CRB-prosjektet 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch prosjekt 1020106; og National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) tildelt Georgios Vidalakis.
0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach |
12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
-20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4×12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |