Vi konstruerade, tillverkade och validerade ett instrument som snabbt bearbetar floemrika barkvävnader från citrusknoppar. Jämfört med nuvarande metoder har budwood tissue extractor (BTE) ökat provgenomströmningen och minskat de nödvändiga arbets- och utrustningskostnaderna.
Transplantatöverförbara, floembegränsade patogener av citrusfrukter som virus, viroider och bakterier är ansvariga för förödande epidemier och allvarliga ekonomiska förluster över hela världen. Till exempel dödade citrus tristeza-viruset över 100 miljoner citrusträd globalt, medan “Candidatus Liberibacter asiaticus” har kostat Florida 9 miljarder dollar. Användningen av patogentestad citrusknoppved för trädförökning är avgörande för hanteringen av sådana patogener. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) vid University of California, Riverside, använder PCR-analyser (polymeraskedjereaktion) för att testa tusentals prover från citrusknoppar varje år för att skydda Kaliforniens citrusfrukter och för att tillhandahålla rena förökningsenheter till National Clean Plant Network. En allvarlig flaskhals i den storskaliga molekylära detektionen av citrusvirus och viroider är bearbetningssteget för växtvävnad.
Korrekt vävnadsberedning är avgörande för extraktion av nukleinsyror av hög kvalitet och nedströms användning i PCR-analyser. Att hacka, väga, frystorka, mala och centrifugera växtvävnad vid låga temperaturer för att undvika nukleinsyranedbrytning är tids- och arbetskrävande och kräver dyr och specialiserad laboratorieutrustning. Denna artikel presenterar valideringen av ett specialiserat instrument konstruerat för att snabbt bearbeta floemrika barkvävnader från citrusknoppved, kallat budwood tissue extractor (BTE). BTE ökar provgenomströmningen med 100 % jämfört med nuvarande metoder. Dessutom minskar det arbetskraften och kostnaden för utrustning. I detta arbete hade BTE-proverna ett DNA-utbyte (80,25 ng/μL) som var jämförbart med CCPP:s handhackningsprotokoll (77,84 ng/μL). Detta instrument och det snabba bearbetningsprotokollet för växtvävnad kan gynna flera citrusdiagnostiska laboratorier och program i Kalifornien och bli ett modellsystem för vävnadsbearbetning för andra vedartade perenna grödor över hela världen.
Transplantatöverförbara floembegränsade patogener av citrusfrukter, såsom viroider, virus och bakterier, har orsakat förödande epidemier och allvarliga ekonomiska förluster i alla citrusproducerande områden i världen. Citrusviroider begränsar produktionsfaktorer på grund av de exokortis- och kakexisjukdomar som de orsakar i ekonomiskt viktiga citrustyper, såsom trifoliat, trifoliathybrider, mandariner, klementiner och mandariner 1,2,3. I Kalifornien är dessa viroidkänsliga citrustyper grunden för den växande och lönsamma marknaden för “lättskalade”, vilket följer den skiftande trenden i konsumenternas preferens för frukter som är lätta att skala, segmenterade och kärnfria 4,5,6. Således regleras citrusviroider enligt California Department of Food and Agriculture (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140”, och laboratorierna i CDFA:s Plant Pest Diagnostics Branch utför tusentals citrusviroidtester årligen 7,8,9,10 . Citrus tristeza-virus (CTV) har orsakat döden av över 100 miljoner citrusträd sedan början av den globala epidemin på 1930-talet 3,9,10,11. I Kalifornien utgör stamgropar och trifoliatbrytande resistensisolat av viruset ett allvarligt hot mot Kaliforniens citrusindustri som omsätter 3,6 miljarder dollar12,13,14. Följaktligen klassificerar CDFA CTV som en reglerad klass A-växtskadegörare, och laboratoriet vid Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) utför omfattande fältundersökningar och tusentals virustester varje år15,16. Bakterien “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) och huanglongbing-sjukdomen (HLB) beräknas ha orsakat nära 9 miljarder dollar i ekonomisk skada för Florida som ett resultat av en 40-procentig minskning av citrusarealen, en 57-procentig minskning av citrusodlingen och en förlust av nästan 8 000 arbetstillfällen17,18. I Kalifornien förutspåddes en hypotetisk 20-procentig minskning av citrusarealen på grund av HLB leda till mer än 8 200 förlorade arbetstillfällen och en minskning av delstatens bruttonationalprodukt med över en halv miljard dollar. Därför spenderar Citrus Pest and Disease Prevention Program över 40 miljoner dollar årligen på undersökningar för att testa, upptäcka och utrota CLas från Kalifornien14,17,19,20.
En viktig del av hanteringen av citrusviroider, virus och bakterier är användningen av patogentestade förökningsmaterial (t.ex. knoppved) för trädproduktion. Patogentestad citrusknoppved produceras och underhålls inom omfattande karantänprogram som använder avancerade tekniker för eliminering och detektion av patogener10,21. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) vid University of California, Riverside, testar tusentals knoppträprover varje år från citrussorter som nyligen importerats till delstaten och USA, samt träd från citrusknoppar, för att skydda Kaliforniens citrus och stödja funktionerna hos National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. För att hantera den stora volymen citrustester är tillförlitliga och kostnadseffektiva patogendetektionsanalyser med hög genomströmning en grundläggande komponent för framgång för program som CCPP 7,10,22.
Även om molekylbaserade patogendetektionsanalyser som polymeraskedjereaktion (PCR) har möjliggjort betydande ökningar av genomströmningen i växtdiagnostiska laboratorier, är enligt vår erfarenhet en av de mest kritiska flaskhalsarna i implementeringen av protokoll med hög genomströmning bearbetningssteget för växtvävnadsprover. Detta gäller särskilt för citrusfrukter eftersom de för närvarande tillgängliga protokollen för bearbetning av floemrika vävnader som bladskaft och knoppvedsbark är arbetskrävande, tidskrävande och kräver dyr och specialiserad laboratorieutrustning. Dessa protokoll kräver handhackning, vägning, frystorkning, malning och centrifugering vid låga temperaturer för att undvika nukleinsyranedbrytning 8,23,24. Vid diagnoslaboratoriet CCPP omfattar provbearbetningen till exempel i) handhackning (6–9 prover/h/operatör), ii) frystorkning (16–24 timmar), iii) pulverisering (30–60 s) och iv) centrifugering (1–2 timmar). Processen kräver också specialutrustning (t.ex. kraftiga safe-lock-rör, slipkulor i rostfritt stål, adaptrar, blad, handskar) och flera delar av dyr laboratorieutrustning (t.ex. ultralåg frys, frystork, vävnadspulveriserare, kryostation med flytande kväve, kylcentrifug).
Som i alla branscher är utrustningsteknik och automatisering av processer nyckeln till att sänka kostnaderna, öka genomströmningen och tillhandahålla högkvalitativa, enhetliga produkter och tjänster. Citrusindustrin behöver billiga instrument för bearbetning av vävnader som kräver minimal skicklighet för att fungera och som därför är lätta att överföra till diagnostiska laboratorier och fältverksamhet för att möjliggöra hög provbearbetningskapacitet för snabb upptäckt av patogener nedströms. Technology Evolving Solutions (TES) och CCPP utvecklade (dvs. designar och tillverkar) och validerade (dvs. testade med citrusprover och jämförde med standardlaboratorieprocedurer) ett billigt (dvs. eliminerade behovet av specialiserad laboratorieutrustning) instrument för snabb bearbetning av floemrika citrusvävnader (dvs. knoppved), kallat budwood tissue extractor (BTE). Som framgår av figur 1 innehåller BTE en baskomponent för ström och kontroller, plus en avtagbar kammare för bearbetning av citrusknoppved. BTE-kammaren består av en slipskiva som är speciellt utformad för att ta bort de floemrika barkvävnaderna från citrusknoppen. Den strimlade barkvävnaden matas snabbt ut genom en glidport till en spruta som innehåller extraktionsbuffert, filtreras och görs redo för nukleinsyraextraktion och rening utan ytterligare hantering eller beredning (figur 1). BTE-systemet innehåller också en papperslös provspårningsapplikation och en integrerad vägningsapplikation, som registrerar provbehandlingsinformationen i en onlinedatabas i realtid.
BTE-systemet har ökat CCPP:s laboratoriediagnostiska kapacitet med över 100 % och har konsekvent producerat extrakt av citrusvävnad som är lämpliga för rening av nukleinsyror av hög kvalitet och nedströms detektion av transplantatöverförbara patogener av citrusfrukter med hjälp av PCR-analyser. Mer specifikt har BTE minskat tiden för vävnadsbearbetning från över 24 timmar till ~3 minuter per prov, ersatt laboratorieinstrument som kostar över 60 000 USD (figur 2, steg 2-4) och möjliggjort bearbetning av större provstorlekar.
Detta dokument presenterar BTE-högkapacitetsbearbetning av citrusbarkvävnadsbearbetning, nukleinsyraextraktion och valideringsdata för patogendetektion med citrusknoppsprover från källträd, inklusive alla lämpliga positiva och negativa kontroller från CCPP Rubidoux Quarantine Facility respektive Lindcove Foundation Facility. Vi presenterar också genomströmnings- och bearbetningstidsförändringarna jämfört med den nuvarande laboratorieproceduren (Figur 2). Dessutom ger detta arbete ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för testlaboratorier för citruspatogener och visar hur BTE kan stödja funktionerna hos patogenrena plantskole-, undersöknings- och utrotningsprogram.
Figur 1: Vävnadsextraktor av knoppträ. BTE innehåller en baskomponent för kraft och kontroller, plus en avtagbar kammare för bearbetning av citrusknoppved. BTE-kammaren består av en slipskiva som är speciellt utformad för att ta bort de floemrika barkvävnaderna från citrusknoppved. Den strimlade barkvävnaden matas snabbt ut genom en glidport i en spruta, filtreras och görs redo för nukleinsyraextraktion och rening utan ytterligare hantering eller förberedelse. Förkortning: BTE = budwood tissue extractor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Steg-för-steg-jämförelse mellan den konventionella handhackningsproceduren i labbet och BTE-bearbetning. BTE-bearbetning involverar bearbetning av citrusbarkvävnad med hög kapacitet, nukleinsyraextraktion och patogendetektering. Tiden för varje steg anges inom parentes. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I och med tillkomsten av HLB-citrussjukdomen har citrusindustrin, tillsynsmyndigheter och diagnostiska laboratorier uppmanats att förlita sig på nukleinsyraextraktionsmetoder med hög genomströmning i kombination med manuell provbearbetning med låg genomströmning och patogendetektionsanalyser som qPCR34 för testning av enskilda träd, i kombination med metoder för sjukdomshantering35. Kaliforniens HLB-positivitetsgrad har gått från 0,01 % 2012 till 1,2 % 2020. Äve…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Cahuilla-folket som de traditionella väktarna av det land där det experimentella arbetet slutfördes. Vi är tacksamma mot professor Norman Ellstrand vid University of California, Riverside, för att ha tillhandahållit labbutrymme för att genomföra forskningsaktiviteter för detta projekt inom ramen för UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Denna forskning stöddes av CDFA – Specialty Crop Block Grant Program (anslag nr 18-0001-055-SC). Ytterligare stöd tillhandahölls också av CRB-projektet 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-projektet 1020106; och National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) tilldelas Georgios Vidalakis.
0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach |
12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
-20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4×12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |