유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

요약

영장류 대뇌 오가노이드의 전기천공법은 영장류(병리)생리학적 신피질 발달에 가까운 모델 시스템에서 다양한 전구체 유형과 뉴런에 일시적인 유전자 변형을 도입하는 정확하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이를 통해 신경 발달 및 진화 과정을 연구 할 수 있으며 질병 모델링에도 적용 할 수 있습니다.

초록

대뇌 피질은 가장 바깥쪽 뇌 구조이며 감각 입력 및 운동 출력 처리를 담당합니다. 그것은 포유류, 특히 영장류에서 고차원인지 능력의 자리로 간주됩니다. 영장류의 뇌에서 유전자 기능을 연구하는 것은 기술적, 윤리적 이유로 인해 어려운 일이지만, 뇌 오가노이드 기술의 확립은 전통적인 영장류 모델(예: 붉은털 원숭이 및 일반 마모셋)뿐만 아니라 이전에는 실험적으로 접근할 수 없었던 영장류 종(예: 유인원)에서 윤리적으로 정당하고 기술적으로 덜 까다로운 시스템. 또한, 인간의 뇌 오가노이드는 신경 발달 및 신경 장애에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

뇌 오가노이드는 뇌 발달의 많은 과정을 요약하기 때문에 진화적 맥락에서 다양한 종의 뇌 발달의 기초가 되는 유전적 결정 요인의 차이점을 식별하고 기능적으로 비교할 수 있는 강력한 도구이기도 합니다. 오가노이드 사용의 가장 큰 장점은 유전자 기능을 테스트할 수 있는 유전자 변형을 도입할 수 있다는 것입니다. 그러나 이러한 수정의 도입은 힘들고 비용이 많이 듭니다. 이 논문은 뇌 오가노이드의 하위 유형인 영장류 대뇌 오가노이드의 심실과 같은 구조 내에서 세포 집단을 유전적으로 변형하는 빠르고 비용 효율적인 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 인간, 침팬지, 붉은털원숭이 및 일반 마모셋 유래 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드의 안정적인 생성을 위한 수정된 프로토콜을 미세주입 및 전기천공 접근법과 결합합니다. 이것은 질병 모델링에도 적용할 수 있는 신경 발달 및 진화 과정 연구를 위한 효과적인 도구를 제공합니다.

서론

대뇌 피질의 (병리) 생리적 발달과 진화를 조사하는 것은 적절한 모델 시스템의 부족으로 인해 방해받는 엄청난 작업입니다. 이전에는 이러한 연구가 2차원 세포 배양 모델(예: 1차 신경 전구체 또는 신경 세포 배양)과 진화적으로 멀리 떨어진 동물 모델(예: 설치류)^에 국한되었습니다^1,2. 이러한 모델은 특정 질문을 해결하는 데 유용하지만 건강 및 질병 상태에서 발달 중인 인간 신피질의 복잡성, 세포 유형 구성, 세포 구조 및 유전자 발현 패턴을 모델링하는 데는 제한적입니다. 이러한 제한은 예를 들어 소두증의 특정 사례에 대해 설명된 바와 같이 인간 질병의 마우스 모델을 인간 상황에 대한 열악한 번역 가능성으로 이끕니다(예: Zhang et ^al.3). 최근에, 인간 신피질 발달의 진화학적, 기능적, 형태학적으로 더 가까운 모델인 형질전환 비인간 영장류가 세포 배양 및 설치류 기반 모델의 많은 한계를 극복함에^{따라 4,5,6,7,8}

프로토콜

1. 영장류 iPSC의 배양

참고: 견고성으로 인해 여기에 제시된 방법은 모든 영장류 iPSC 라인에 적용할 수 있습니다. 이 글에서는 인간(iLonza2.2)29, 침팬지(Sandra A)³⁰, 붉은털원숭이(iRh33.1)²⁹ 및 일반적인 마모셋(cj_160419_5)³¹ iPSC 계통의 대뇌 오가노이드 생산에 대해 설명합니다. 배양 조건은 표 1에 요약되어 있다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 각 iPSC를 배양하려면 원래 설명된 배양 조건을 따르십시오. 일반적으로 대뇌 오가노이드의 성공적인 생성 및 전기천공을 위해서는 90계대 이상 배양되지 않은 iPSC 라인을 사용합니다. 또한 대뇌 오가노이드 생성 시작 시 iPSC가 분화의 징후 없이 만능의 특징을 나타내는지 확인합니다.

2. 영장류 iPSC에서 대뇌 오가노이드 생성

결과

여기에 설명된 프로토콜은 종 간에 필요한 타이밍 변경을 최소화하면서 인간, 침팬지, 붉은털 원숭이 및 일반적인 마모셋 iPSC 계통에서 대뇌 오가노이드를 효율적으로 생성할 수 있도록 합니다(그림 1A). 이러한 오가노이드는 심실과 같은 구조의 접근성과 관심 있는 세포 집단의 풍부도에 따라 20dps에서 50dps 범위에서 전기천공될 수 있습니다. 그러나 전기천공에 앞서 대뇌 오가노이드가 전기천공을 하기에 충분한 품질인지 여부를 결정하는 것이 중요합니다.

전기천공에 이상적인 대뇌 오가노이드는 말초에 뚜렷한 밝은 심실과 같은 구조를 나타내야 하며, 퇴행의 징후가 없어야 하며(예: 세포 분리, 세포사멸 코어 확대) 일반적으로 조밀한 건강한 형태(예: 과도한 성장 없음)를 나타내야 합니다(그림 1B, "Go"). 더 많은 수의 세포를 표적으로 삼기 위해 크고 잘 조직된 심실과 같은.......

토론

여기에 설명된 절차는 표적 전기천공 접근법을 사용하여 다양한 영장류 종에서 대뇌 오가노이드를 생성하기 위한 통합 프로토콜을 나타냅니다. 이것은 영장류(인간 포함)(병리)생리학적 신피질 발달을 모방하는 모델 시스템에서 GOI의 이소성 발현을 허용합니다. 영장류 대뇌 오가노이드 생성을 위한 이 통합 프로토콜은 제시된 4가지 영장류 종 모두에 대해 동일한 재료(예: 배지) 및 프로토콜 단계를 사용합니다. 이러한 종 간의 발달 차이는 중요한 프로토콜 단계(즉, 신경 유도 및 기저막 매트릭스에 임베딩, 위 참조)의 타이밍을 변경하여 해결됩니다. 이것은 이들 종 간의 생체 내 신경 발달 타이밍 차이를 대략적으로 반영할 수 있으며 추가 연구를 위한 흥미로운 주제를 구성합니다.

이 접근법은 대뇌 오가노이드에 대한 이전 논문에서 설명한 전기천공 실험을 기반으로 한다¹⁰. 그러나, 랭커스터와 동료들에 의해 지적된 바와 같이, 이러한 실험은.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
20 & 마이크로; L 마이크로로더	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm 세포 배양 접시	Sarstedt	83.3900
60 mm 세포 배양 접시	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 도립 형광 현미경	Zeiss		유사한 형광 현미경으로 대체
가능 AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 비타민 A 보충제(레티노산, RA)(50개)	Gibco	17504-044
비타민 A 없는 B-27 보충제(50개)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 구형파 전기천공법 시스템	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
침팬지 유도 만능 줄기 세포주 Sandra 도			이: 10.7554/elife.18683
일반적인 마모셋 유도 만능 줄기 세포주 cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0− 7.3; 사용 전 실온으로 따뜻하게 하세요
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 실체현미경(MDG 17 투과광 베이스)	Leica	10473849	유사한 실체현미경으로 교체 가능
Matrigel	Corning	354277/354234	기저막 매트릭스; 대안적으로, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302)를 사용할 수 있습니다
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
파라포름알데히드	Merck	818715	암 발생성으로 인한 인과 관계 페
니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
페트리 접시 전극 챔버	자체 생산(보충 파일 1 참조)		또한 상업적으로 사용 가능한
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	긴 테이퍼가 있는 붕규산 유리 피펫, 10 µ m 팁 직경
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
재조합 인간/쥐/쥐뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)	PeproTech	AF-450-02
붉은털 원숭이 유도 만능 줄기 세포주 iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase 세포 해리 시약	Gibco	A1110501	단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 혼합물
TrypLE	Gibco	12604-013	재조합 트립신 대체물; 사용 전 실온으로 데우
기 초저 부착 96웰 플레이트	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305

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