Elektroporering av primater cerebrale organoider gir en presis og effektiv tilnærming til å introdusere forbigående genetisk modifikasjon (er) i forskjellige stamtyper og nevroner i et modellsystem nær primat (pato) fysiologisk neocortex utvikling. Dette tillater studier av nevrodevelopmental og evolusjonære prosesser og kan også brukes til sykdomsmodellering.
Hjernebarken er den ytterste hjernestrukturen og er ansvarlig for behandlingen av sensorisk inngang og motorisk utgang; Det blir sett på som sete for høyere ordens kognitive evner hos pattedyr, spesielt primater. Å studere genfunksjoner i primathjerner er utfordrende av tekniske og etiske årsaker, men etableringen av hjerneorganoidteknologien har gjort det mulig å studere hjernens utvikling i tradisjonelle primatmodeller (f.eks. Rhesus macaque og vanlig marmoset), så vel som i tidligere eksperimentelt utilgjengelige primatarter (f.eks. Store aper), i et etisk forsvarlig og mindre teknisk krevende system. Videre tillater menneskelige hjerneorganoider avansert undersøkelse av nevrodevelopmental og nevrologiske lidelser.
Som hjerneorganoider rekapitulerer mange prosesser for hjernens utvikling, representerer de også et kraftig verktøy for å identifisere forskjeller i, og funksjonelt sammenligne, de genetiske determinanter som ligger til grunn for hjernens utvikling av ulike arter i en evolusjonær sammenheng. En stor fordel ved å bruke organoider er muligheten til å innføre genetiske modifikasjoner, som tillater testing av genfunksjoner. Innføringen av slike modifikasjoner er imidlertid arbeidskrevende og dyr. Denne artikkelen beskriver en rask og kostnadseffektiv tilnærming til genetisk modifisering av cellepopulasjoner innenfor ventrikkellignende strukturer av primat-cerebrale organoider, en subtype av hjerneorganoider. Denne metoden kombinerer en modifisert protokoll for pålitelig generering av cerebrale organoider fra menneske-, sjimpanse-, rhesusmakak- og vanlige marmoset-avledede induserte pluripotente stamceller (iPSCs) med en mikroinjeksjons- og elektroporeringstilnærming. Dette gir et effektivt verktøy for studiet av nevrodevelopmental og evolusjonære prosesser som også kan brukes til sykdomsmodellering.
Å undersøke (pato)fysiologisk utvikling og utvikling av hjernebarken er en formidabel oppgave som hemmes av mangelen på egnede modellsystemer. Tidligere var slike studier begrenset til todimensjonale cellekulturmodeller (som primære nevrale stamceller eller nevroncellekulturer) og evolusjonært fjerne dyremodeller (som gnagere)1,2. Selv om disse modellene er nyttige for å ta opp visse spørsmål, er de begrenset i modellering av kompleksiteten, celletypesammensetningen, cellulær arkitektur og genuttrykksmønstre i den utviklende humane neocortex i sunne og syke tilstander. Disse begrensningene fører for eksempel til dårlig oversettbarhet av musemodeller av menneskelige sykdommer til den menneskelige situasjonen, som beskrevet for visse tilfeller av mikrocefali (f.eks. Zhang et al.3). Nylig har transgene ikke-menneskelige primater, som er en evolusjonært, funksjonelt og morfologisk nærmere modell for utvikling av menneskelig neocortex, kommet i fokus 4,5,6,7,8 da de overvinner mange begrensninger i cellekultur- og gnagerbaserte modeller. Bruk av ikke-menneskelige primater i forskning er imidlertid ikke bare svært kostbart og tidkrevende, men reiser også etiske bekymringer. Mer nylig har utviklingen av hjerneorganoidteknologi 9,10 dukket opp som et lovende alternativ som løser mange av begrensningene til tidligere modeller 11,12,13,14,15,16.
Hjerneorganoider er tredimensjonale (3D), flercellede strukturer som etterligner hovedtrekkene i cytoarkitekturen og celletypesammensetningen til en eller flere hjernegrupper for et definert utviklingstidsvindu 11,12,13,14,17. Disse 3D-strukturene genereres enten fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) eller, hvis tilgjengelig for artene av interesse, fra embryonale stamceller (ESC). Generelt kan to typer hjerneorganoider skilles ut fra metoden som brukes: ikke-styrte og regionaliserte (guidede) hjerneorganoider18. Ved generering av sistnevnte type organoider er det gitt små molekyler eller faktorer som styrer differensieringen av de pluripotente stamcellene til organoider i en bestemt hjernegruppe (f.eks. Forhjerneorganoider)18. I motsetning til dette, i ikke-styrte organoider, styres differensieringen ikke av tilsetning av små molekyler, men er utelukkende avhengig av spontan differensiering av iPSCs / ESCs. De resulterende hjerneorganoidene består av celletyper som representerer forskjellige hjernegrupper (f.eks. cerebrale organoider)18. Hjerneorganoider kombinerer mange viktige funksjoner i hjernens utvikling med relativt kostnadseffektiv og tidseffektiv generering fra alle arter av interesse som iPSCs eller ESCs er tilgjengelige for11,12,13,14. Dette gjør hjerneorganoider til en utmerket modell for mange typer nevrobiologiske studier, alt fra evolusjonære og utviklingsspørsmål til sykdomsmodellering og narkotikatesting15,16. Å ta opp slike spørsmål ved hjelp av hjerneorganoider avhenger imidlertid sterkt av tilgjengeligheten av forskjellige metoder for genetisk modifikasjon.
Et viktig aspekt ved å studere neocortex (pato)fysiologisk utvikling og dens utvikling er funksjonell analyse av gener og genvarianter. Dette oppnås vanligvis ved (ektopisk) uttrykk og / eller ved knock-down (KD) eller knock-out (KO) av disse genene. Slike genetiske modifikasjoner kan klassifiseres i stabil og forbigående genetisk modifikasjon, samt at modifikasjonene er tidsmessig og romlig begrenset eller ikke begrenset. Stabil genetisk modifikasjon er definert ved innføring av en genetisk endring i vertsgenomet som overføres til alle påfølgende cellegenerasjoner. Avhengig av tidspunktet for genetisk modifisering, kan det påvirke alle cellene i en organoid eller kan begrenses til visse cellepopulasjoner. Oftest oppnås stabil genetisk modifikasjon i hjerneorganoider på iPSC / ESC-nivå ved å anvende lentivirus, transposonlignende systemer og CRISPR / Cas9-teknologien (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 og Teriyapirom et al.20). Dette har fordelen at alle celler i hjerneorganoiden bærer den genetiske modifikasjonen, og at den ikke er tidsmessig eller romlig begrenset. Imidlertid er generering og karakterisering av disse stabile iPSC / ESC-linjene svært tidkrevende, og tar ofte flere måneder før de første modifiserte hjerneorganoidene kan analyseres (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 eller Teriyapirom et al.20).
I motsetning til dette er forbigående genetisk modifikasjon definert ved levering av genetisk last (f.eks. Et genuttrykksplasmid) som ikke integreres i vertsgenomet. Selv om denne modifikasjonen i prinsippet kan overføres til etterfølgende cellegenerasjoner, vil den leverte genetiske lasten gradvis fortynnes med hver celledeling. Derfor er denne typen genetisk modifikasjon vanligvis tidsmessig og romlig begrenset. Forbigående genetisk modifikasjon kan utføres i hjerneorganoider ved adenoassosierte virus eller ved elektroporering (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 og Teriyapirom et al.20), med sistnevnte beskrevet i detalj i denne artikkelen. I motsetning til stabil genmodifisering er denne tilnærmingen svært rask og kostnadseffektiv. Faktisk kan elektroporering utføres i løpet av minutter, og avhengig av målcellepopulasjonen (e), er elektroporerte organoider klare for analyse innen dager (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17 og Kyrousi et al.19). Imidlertid kan brutto morfologiske endringer i hjerneorganoiden, som forskjeller i størrelse, ikke oppdages ved hjelp av denne metoden, da denne typen genetisk modifikasjon er tidsmessig og romlig begrenset. Denne begrensningen kan også være en fordel, for eksempel ved å studere individuelle cellepopulasjoner i organoiden eller effektene på hjerneorganoider ved bestemte utviklingstidspunkter (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17 og Kyrousi et al.19).
En klassisk tilnærming til å studere genfunksjon under hjernens utvikling og evolusjon er i utero elektroporering. I utero er elektroporering en velkjent og nyttig teknikk for levering av genuttrykkskonstruksjoner i gnagere 21,22,23 og 24,25 hjerner. Først mikroinjiseres en løsning som inneholder uttrykkskonstruksjonen(e) av interesse gjennom livmorveggen inn i en bestemt ventrikkel i den embryonale hjernen, avhengig av regionen som skal målrettes. I det andre trinnet brukes elektriske pulser for å transfektere cellene som direkte fôrer den målrettede ventrikkelen. Denne tilnærmingen er ikke bare begrenset til ektopisk uttrykk eller overekspresjon av gener, da den også kan brukes i KD- eller KO-studier ved å mikroinjisere kort hårnål (shRNA) eller CRISPR/Cas9 (i form av ekspresjonsplasmider eller ribonukleoproteiner [RNP]), henholdsvis26,27. Imidlertid har in utero elektroporering av mus, rotte og ilderembryoer de samme begrensningene som beskrevet ovenfor for disse dyremodellene.
Ideelt sett ønsker man å utføre i utero elektroporering direkte i primater. Selv om dette i prinsippet er teknisk mulig, utføres ikke elektroporering in utero hos primater på grunn av etiske bekymringer, høye vedlikeholdskostnader for dyr og små kullstørrelser. For visse primater, som store aper (inkludert mennesker), er dette ikke mulig i det hele tatt. Imidlertid har disse primatene det største potensialet for studiet av menneskelig (pato)fysiologisk neocortex-utvikling og dens utvikling. En løsning på dette dilemmaet er å anvende elektroporasjonsteknikken på primathjerneorganoider28.
Dette papiret presenterer en protokoll for elektroporering av en subtype av primathjerneorganoider, primater, cerebrale organoider. Denne tilnærmingen tillater rask og kostnadseffektiv genetisk modifisering av cellepopulasjoner innenfor de ventrikkellignende strukturer av organoider. Spesielt beskriver vi en enhetlig protokoll for generering av primater cerebrale organoider fra mennesker (Homo sapiens), sjimpanse (Pan troglodytes), rhesus macaque (Macaca mulatta) og vanlig marmoset (Callithrix jacchus) iPSCs. Videre beskriver vi mikroinjeksjons- og elektroporasjonsteknikken i detalj og gir “go” og “no-go” kriterier for å utføre primat cerebral organoid elektroporering. Denne tilnærmingen er et effektivt verktøy for å studere (pato)fysiologisk neocortex-utvikling og dens utvikling i en modell spesielt nær den menneskelige situasjonen.
Prosedyrene beskrevet her representerer en enhetlig protokoll for generering av cerebrale organoider fra forskjellige primatarter med en målrettet elektroporasjonstilnærming. Dette tillater ektopisk uttrykk for en GOI i et modellsystem som emulerer primat (inkludert menneske) (pato) fysiologisk neocortex utvikling. Denne enhetlige protokollen for generering av primat-cerebrale organoider bruker de samme materialene (f.eks. Media) og protokolltrinnene for alle fire primatarter som presenteres. Utviklingsforskjeller mell…
The authors have nothing to disclose.
Vi beklager til alle forskerne hvis arbeid ikke kunne siteres på grunn av plassbegrensninger. Vi takker Ulrich Bleyer fra de tekniske tjenestene ved DPZ og Hartmut Wolf fra verkstedet på MPI-CBG for byggingen av petriskakelektrodekamrene; Stoyan Petkov og Rüdiger Behr for å gi menneskelige (iLonza2.2), rhesus macaque (iRh33.1) og marmoset (cj_160419_5) iPSCs; Sabrina Heide for kryoseksjonering og immunfluorescensfarging; og Neringa Liutikaite og César Mateo Bastidas Betancourt for kritisk lesing av manuskriptet. Arbeid i laboratoriet til WBH ble støttet av et ERA-NET NEURON (MicroKin) stipend. Arbeidet i laboratoriet til M.H. ble støttet av et ERC-startstipend (101039421).
20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |