Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética
Summary
A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.
Abstract
O córtex cerebral é a estrutura cerebral mais externa e é responsável pelo processamento da entrada sensorial e da saída motora; É visto como a sede de habilidades cognitivas de ordem superior em mamíferos, em particular, primatas. Estudar as funções gênicas em cérebros de primatas é um desafio devido a razões técnicas e éticas, mas o estabelecimento da tecnologia organoide cerebral permitiu o estudo do desenvolvimento cerebral em modelos tradicionais de primatas (por exemplo, macaco rhesus e sagui-comum), bem como em espécies de primatas anteriormente inacessíveis experimentalmente (por exemplo, grandes macacos), em um sistema eticamente justificável e menos exigente tecnicamente. Além disso, organoides cerebrais humanos permitem a investigação avançada de distúrbios neurológicos e do neurodesenvolvimento.
Como os organoides cerebrais recapitulam muitos processos de desenvolvimento cerebral, eles também representam uma ferramenta poderosa para identificar diferenças e comparar funcionalmente os determinantes genéticos subjacentes ao desenvolvimento cerebral de várias espécies em um contexto evolutivo. Uma grande vantagem do uso de organoides é a possibilidade de introduzir modificações genéticas, o que permite testar as funções dos genes. No entanto, a introdução de tais modificações é trabalhosa e cara. Este artigo descreve uma abordagem rápida e econômica para modificar geneticamente populações celulares dentro das estruturas semelhantes a ventrículos de organoides cerebrais de primatas, um subtipo de organoides cerebrais. Este método combina um protocolo modificado para a geração confiável de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de saguis humanos, chimpanzés, macacos rhesus e saguis comuns com uma abordagem de microinjeção e eletroporação. Isso fornece uma ferramenta eficaz para o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos que também pode ser aplicada para modelagem de doenças.
Introduction
Investigar o desenvolvimento (pato)fisiológico e a evolução do córtex cerebral é uma tarefa formidável que é dificultada pela falta de sistemas modelo adequados. Anteriormente, tais estudos estavam confinados a modelos bidimensionais de cultura celular (como progenitor neural primário ou culturas de células neuronais) e modelos animais evolutivamente distantes (como roedores)1,2. Embora esses modelos sejam úteis para abordar certas questões, eles são limitados na modelagem da complexidade, composição do tipo celular, arquitetura celular e padrões de expressão gênica do neocórtex humano em desenvolvimento em estados saudáveis e doentes. Essas limitações levam, por exemplo, à baixa traduzibilidade de modelos murinos de doenças humanas para a situação humana, como descrito para certos casos de microcefalia (por exemplo, Zhang et al.3). Recentemente, primatas não humanos transgênicos, que são um modelo evolutiva, funcional e morfologicamente mais próximo do desenvolvimento do neocórtex humano, têm entrado em foco 4,5,6,7,8 à medida que superam muitas limitações dos modelos baseados em cultura celular e roedores. No entanto, o uso de primatas não humanos em pesquisas não é apenas altamente caro e demorado, mas também levanta preocupações éticas. Mais recentemente, o desenvolvimento da tecnologia de organoidescerebrais9,10 surgiu como uma alternativa promissora que resolve muitas das limitações de modelos anteriores11,12,13,14,15,16.
Os organoides cerebrais são estruturas tridimensionais (3D), multicelulares, que emulam as principais características da citoarquitetura e composição celular-tipo de uma ou múltiplas regiões cerebrais para uma janela de tempo de desenvolvimento definida11,12,13,14,17. Essas estruturas 3D são geradas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ou, se disponíveis para a espécie de interesse, a partir de células-tronco embrionárias (CTEs). Em geral, dois tipos de organoides cerebrais podem ser distinguidos com base na metodologia utilizada: organoides cerebrais não guiados e regionalizados (guiados)18. Na geração deste último tipo de organoides, são fornecidas pequenas moléculas ou fatores que orientam a diferenciação das células-tronco pluripotentes em organoides de uma determinada região do cérebro (por exemplo, organoides do prosencéfalo)18. Por outro lado, em organoides não guiados, a diferenciação não é guiada pela adição de pequenas moléculas, mas depende exclusivamente da diferenciação espontânea das iPSCs/ESCs. Os organoides cerebrais resultantes consistem em tipos celulares que representam diferentes regiões cerebrais (por exemplo, organoides cerebrais)18. Os organoides cerebrais combinam muitas características-chave do desenvolvimento cerebral com uma geração relativamente eficiente em termos de custo e tempo a partir de qualquer espécie de interesse para a qual as iPSCs ou ESCs estejam disponíveis11,12,13,14. Isso faz dos organoides cerebrais um excelente modelo para muitos tipos de estudos neurobiológicos, desde questões evolutivas e de desenvolvimento até modelagem de doenças e testes de drogas15,16. No entanto, a abordagem de tais questões usando organoides cerebrais depende fortemente da disponibilidade de diferentes métodos para modificação genética.
Um aspecto fundamental do estudo do desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex e sua evolução é a análise funcional de genes e variantes gênicas. Isso geralmente é conseguido pela expressão (ectópica) e/ou por knock-down (KD) ou knock-out (KO) desses genes. Tais modificações genéticas podem ser classificadas em modificações genéticas estáveis e transitórias, bem como em modificações restritas temporal e espacialmente ou não restritas. A modificação genética estável é definida pela introdução de uma alteração genética no genoma do hospedeiro que é transmitida a todas as gerações celulares subsequentes. Dependendo do momento da modificação genética, pode afetar todas as células de um organoide ou pode ser restrito a determinadas populações celulares. Mais frequentemente, a modificação genética estável é obtida em organoides cerebrais no nível iPSC/ESC através da aplicação de lentivírus, sistemas semelhantes a transposons e a tecnologia CRISPR/Cas9 (revisada por, por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 e Teriyapirom et al.20). Isso tem a vantagem de que todas as células do organoide cerebral carregam a modificação genética e que ela não é restrita temporal ou espacialmente. No entanto, a geração e a caracterização dessas linhagens estáveis de iPSC/ESC são muito demoradas, muitas vezes levando vários meses até que os primeiros organoides cerebrais modificados possam ser analisados (revisados por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 ou Teriyapirom et al.20).
Em contraste, a modificação genética transitória é definida pela entrega de carga genética (por exemplo, um plasmídeo de expressão gênica) que não se integra ao genoma do hospedeiro. Embora essa modificação possa, em princípio, ser passada para as gerações celulares subsequentes, a carga genética entregue será progressivamente diluída a cada divisão celular. Portanto, esse tipo de modificação genética costuma ser restrita temporal e espacialmente. A modificação genética transitória pode ser realizada em organoides cerebrais por vírus adenoassociados ou por eletroporação (revisada por, por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 e Teriyapirom et al.20), sendo esta última descrita em detalhes neste artigo. Em contraste com a modificação genética estável, esta abordagem é muito rápida e econômica. De fato, a eletroporação pode ser realizada em poucos minutos e, dependendo da(s) população(ões) de células-alvo, os organoides eletroporados estão prontos para análise em poucos dias (revisados por, por exemplo, Fischer et al.17 e Kyrousi et al.19). No entanto, alterações morfológicas macroscópicas do organoide cerebral, como diferenças de tamanho, não podem ser detectadas por esse método, pois esse tipo de modificação genética é restrita temporal e espacialmente. Essa restrição também pode ser uma vantagem, por exemplo, no caso de estudar populações celulares individuais dentro do organoide ou os efeitos sobre organoides cerebrais em momentos específicos de desenvolvimento (revisados por, por exemplo, Fischer et al.17 e Kyrousi et al.19).
Uma abordagem clássica para estudar a função gênica durante o desenvolvimento e evolução cerebral é a eletroporação in utero. A eletroporação in utero é uma técnica bem conhecida e útil para a liberação de construções de expressão gênica em cérebros de roedores 21,22,23 e furões 24,25. Primeiro, uma solução contendo o(s) construto(s) de expressão de interesse é microinjetada através da parede uterina em um determinado ventrículo do cérebro embrionário, dependendo da região a ser alvo. Na segunda etapa, pulsos elétricos são aplicados para transfectar as células que revestem diretamente o ventrículo alvo. Essa abordagem não se limita apenas à expressão ectópica ou à superexpressão de genes, como também pode ser aplicada em estudos de KD ou KO por microinjeção de hairpin curto (shRNA) ou CRISPR/Cas9 (na forma de plasmídeos de expressão ou ribonucleoproteínas [RNPs]), respectivamente26,27. No entanto, a eletroporação in utero de embriões de camundongos, ratos e furões tem as mesmas limitações descritas acima para esses modelos animais.
O ideal seria realizar eletroporação in utero diretamente em primatas. Embora isso seja, em princípio, tecnicamente possível, a eletroporação in utero não é realizada em primatas devido a preocupações éticas, altos custos de manutenção animal e pequenos tamanhos de ninhada. Para certos primatas, como grandes símios (incluindo humanos), isso não é possível. No entanto, esses primatas têm o maior potencial para o estudo do desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex humano e sua evolução. Uma solução para esse dilema é aplicar a técnica de eletroporação aos organoides cerebrais de primatas28.
Este trabalho apresenta um protocolo para a eletroporação de um subtipo de organoides cerebrais de primatas, organoides cerebrais de primatas. Essa abordagem permite a modificação genética rápida e econômica de populações celulares dentro das estruturas semelhantes aos ventrículos dos organoides. Especificamente, descrevemos um protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de primatas a partir de iPSCs humanas (Homo sapiens), chimpanzés (Pan troglodytes), macacos rhesus (Macaca mulatta) e sagui-comum (Callithrix jacchus). Além disso, descrevemos a técnica de microinjeção e eletroporação em detalhes e fornecemos critérios “go” e “no-go” para a realização da eletroporação organoide cerebral de primatas. Esta abordagem é uma ferramenta eficaz para estudar o desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex e sua evolução em um modelo especialmente próximo da situação humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os procedimentos aqui descritos representam um protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de diferentes espécies de primatas com uma abordagem de eletroporação direcionada. Isso permite a expressão ectópica de um GOI em um sistema modelo que emula o desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex de primatas (incluindo humanos). Este protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de primatas usa os mesmos materiais (por exemplo, mídia) e etapas de protocolo para todas as quatro esp?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pedimos desculpas a todos os pesquisadores cujos trabalhos não puderam ser citados por limitações de espaço. Agradecemos a Ulrich Bleyer dos serviços técnicos da DPZ e Hartmut Wolf da oficina do MPI-CBG pela construção das câmaras de eletrodos de placa de Petri; Stoyan Petkov e Rüdiger Behr pelo fornecimento de iPSCs humanos (iLonza2.2), macacos rhesus (iRh33.1) e saguis (cj_160419_5); Sabrina Heide pela criossecção e coloração por imunofluorescência; e Neringa Liutikaite e César Mateo Bastidas Betancourt pela leitura crítica do manuscrito. O trabalho no laboratório de W.B.H. foi apoiado por uma bolsa ERA-NET NEURON (MicroKin). O trabalho no laboratório de M.H. foi apoiado por uma bolsa inicial do ERC (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. 발생학. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
