Riktad mikroinjektion och elektroporering av primatcerebrala organoider för genetisk modifiering
Summary
Elektroporering av primatcerebrala organoider ger ett exakt och effektivt tillvägagångssätt för att introducera övergående genetisk modifiering (er) i olika stamtyper och neuroner i ett modellsystem nära primat (pato) fysiologisk neocortexutveckling. Detta möjliggör studier av neurodevelopmental och evolutionära processer och kan också tillämpas för sjukdomsmodellering.
Abstract
Hjärnbarken är den yttersta hjärnstrukturen och ansvarar för behandlingen av sensorisk inmatning och motorutgång; Det ses som säte för högre ordningens kognitiva förmågor hos däggdjur, i synnerhet primater. Att studera genfunktioner i primathjärnor är utmanande på grund av tekniska och etiska skäl, men etableringen av hjärnorganoidtekniken har möjliggjort studier av hjärnans utveckling i traditionella primatmodeller (t.ex. rhesusmakak och vanlig marmoset), liksom i tidigare experimentellt otillgängliga primatarter (t.ex. stora apor), i ett etiskt motiverat och mindre tekniskt krävande system. Dessutom tillåter mänskliga hjärnorganoider avancerad undersökning av neurodevelopmental och neurologiska störningar.
Eftersom hjärnorganoider rekapitulerar många processer av hjärnans utveckling, representerar de också ett kraftfullt verktyg för att identifiera skillnader i och att funktionellt jämföra de genetiska determinanterna som ligger till grund för hjärnans utveckling av olika arter i ett evolutionärt sammanhang. En stor fördel med att använda organoider är möjligheten att införa genetiska modifieringar, vilket möjliggör testning av genfunktioner. Införandet av sådana modifieringar är dock mödosamt och dyrt. Detta dokument beskriver ett snabbt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att genetiskt modifiera cellpopulationer inom de ventrikelliknande strukturerna hos primatcerebrala organoider, en subtyp av hjärnorganoider. Denna metod kombinerar ett modifierat protokoll för tillförlitlig generering av cerebrala organoider från humana, schimpans-, rhesusmakak- och vanliga marmoset-härledda inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) med en mikroinjektions- och elektroporeringsmetod. Detta ger ett effektivt verktyg för studier av utvecklingsneurologiska och evolutionära processer som också kan tillämpas för sjukdomsmodellering.
Introduction
Att undersöka den (pato)fysiologiska utvecklingen och evolutionen av hjärnbarken är en formidabel uppgift som försvåras av bristen på lämpliga modellsystem. Tidigare var sådana studier begränsade till tvådimensionella cellodlingsmodeller (såsom primära neurala stamceller eller neuronala cellkulturer) och evolutionärt avlägsna djurmodeller (såsom gnagare)1,2. Även om dessa modeller är användbara för att ta itu med vissa frågor, är de begränsade när det gäller att modellera komplexiteten, celltypskompositionen, cellulär arkitektur och genuttrycksmönster hos den utvecklande mänskliga neocortexen i friska och sjuka tillstånd. Dessa begränsningar leder till exempel till dålig översättningsbarhet av musmodeller av mänskliga sjukdomar till den mänskliga situationen, som beskrivs för vissa fall av mikrocefali (t.ex. Zhang et al.3). Nyligen har transgena icke-mänskliga primater, som är en evolutionärt, funktionellt och morfologiskt närmare modell av mänsklig neocortexutveckling, kommit i fokus 4,5,6,7,8 eftersom de övervinner många begränsningar av cellodlings- och gnagarbaserade modeller. Användningen av icke-mänskliga primater i forskning är dock inte bara mycket dyr och tidskrävande utan ger också upphov till etiska betänkligheter. På senare tid har utvecklingen av hjärnorganoidteknik9,10 framstått som ett lovande alternativ som löser många av begränsningarna i tidigare modeller 11,12,13,14,15,16.
Hjärnorganoider är tredimensionella (3D), multicellulära strukturer som efterliknar huvuddragen i cytoarkitekturen och celltypsammansättningen i en eller flera hjärnregioner för ett definierat utvecklingstidsfönster 11,12,13,14,17. Dessa 3D-strukturer genereras antingen från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) eller, om sådana finns tillgängliga för arten av intresse, från embryonala stamceller (ESC). I allmänhet kan två typer av hjärnorganoider särskiljas baserat på den använda metoden: ostyrda och regionaliserade (guidade) hjärnorganoider18. Vid generering av den senare typen av organoider tillhandahålls små molekyler eller faktorer som styr differentieringen av de pluripotenta stamcellerna till organoider i en viss hjärnregion (t.ex. organoider i framhjärnan)18. I ostyrda organoider styrs differentieringen däremot inte av tillsatsen av små molekyler utan förlitar sig uteslutande på spontan differentiering av iPSC/ESC. De resulterande hjärnorganoiderna består av celltyper som representerar olika hjärnregioner (t.ex. cerebrala organoider)18. Hjärnorganoider kombinerar många viktiga funktioner i hjärnans utveckling med relativt kostnads- och tidseffektiv generering från alla arter av intresse för vilka iPSC eller ESC finns tillgängliga11,12,13,14. Detta gör hjärnorganoider till en utmärkt modell för många typer av neurobiologiska studier, allt från evolutionära och utvecklingsfrågor till sjukdomsmodellering och läkemedelstestning15,16. Att ta itu med sådana frågor med hjälp av hjärnorganoider beror dock starkt på tillgången på olika metoder för genetisk modifiering.
En viktig aspekt av att studera neocortex (pato) fysiologisk utveckling och dess utveckling är funktionell analys av gener och genvarianter. Detta uppnås vanligtvis genom (ektopisk) uttryck och / eller genom knock-down (KD) eller knock-out (KO) av dessa gener. Sådana genetiska modifieringar kan klassificeras i stabil och övergående genetisk modifiering, liksom i modifieringar som är tidsmässigt och rumsligt begränsade eller inte begränsade. Stabil genetisk modifiering definieras genom införandet av en genetisk förändring i värdgenomet som överförs till alla efterföljande cellgenerationer. Beroende på tidpunkten för genetisk modifiering kan den påverka alla celler i en organoid eller kan begränsas till vissa cellpopulationer. Oftast uppnås stabil genetisk modifiering i hjärnorganoider på iPSC / ESC-nivå genom att tillämpa lentivirus, transposonliknande system och CRISPR / Cas9-tekniken (granskad av t.ex. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 och Teriyapirom et al.20). Detta har fördelen att alla celler i hjärnorganoiden bär den genetiska modifieringen och att den inte är tidsmässigt eller rumsligt begränsad. Genereringen och karakteriseringen av dessa stabila iPSC / ESC-linjer är dock mycket tidskrävande och tar ofta flera månader tills de första modifierade hjärnorganoiderna kan analyseras (granskad av t.ex. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 eller Teriyapirom et al.20).
Däremot definieras övergående genetisk modifiering genom leverans av genetisk last (t.ex. en genuttrycksplasmid) som inte integreras i värdgenomet. Även om denna modifiering i princip kan överföras till efterföljande cellgenerationer, kommer den levererade genetiska lasten gradvis att spädas ut med varje celldelning. Därför är denna typ av genetisk modifiering vanligtvis tidsmässigt och rumsligt begränsad. Övergående genetisk modifiering kan utföras i hjärnorganoider av adenoassocierade virus eller genom elektroporering (granskad av t.ex. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 och Teriyapirom et al.20), där den senare beskrivs i detalj i denna artikel. Till skillnad från stabil genetisk modifiering är detta tillvägagångssätt mycket snabbt och kostnadseffektivt. Elektroporering kan utföras inom några minuter, och beroende på målcellpopulationen (erna) är elektroporerade organoider redo för analys inom några dagar (granskade av t.ex. Fischer et al.17 och Kyrousi et al.19). Grova morfologiska förändringar av hjärnorganoiden, såsom skillnader i storlek, kan emellertid inte detekteras med denna metod, eftersom denna typ av genetisk modifiering är tidsmässigt och rumsligt begränsad. Denna begränsning kan också vara en fördel, till exempel när det gäller att studera enskilda cellpopulationer inom organoiden eller effekterna på hjärnorganoider vid specifika utvecklingstidpunkter (granskad av t.ex. Fischer et al.17 och Kyrousi et al.19).
Ett klassiskt tillvägagångssätt för att studera genfunktion under hjärnans utveckling och evolution är i utero elektroporering. In utero elektroporering är en välkänd och användbar teknik för leverans av genuttryckskonstruktioner i gnagare 21,22,23 och iller 24,25 hjärnor. Först mikroinjiceras en lösning som innehåller uttryckskonstruktionen (erna) av intresse genom livmoderväggen in i en viss ventrikel i den embryonala hjärnan, beroende på vilken region som ska riktas. I det andra steget appliceras elektriska pulser för att transfektera cellerna direkt som fodrar den riktade ventrikeln. Detta tillvägagångssätt är inte bara begränsat till ektopiskt uttryck eller överuttryck av gener, eftersom det också kan tillämpas i KD- eller KO-studier genom mikroinjicering av kort hårnål (shRNA) eller CRISPR / Cas9 (i form av expressionsplasmider eller ribonukleoproteiner [RNP]), respektive26,27. Elektroporering in utero av mus-, rått- och illerembryon har dock samma begränsningar som beskrivits ovan för dessa djurmodeller.
Helst skulle man vilja utföra i utero elektroporering direkt i primater. Även om detta i princip är tekniskt möjligt, utförs elektroporering i livmodern inte på primater på grund av etiska problem, höga djurunderhållskostnader och små kullstorlekar. För vissa primater, såsom stora apor (inklusive människor), är detta inte möjligt alls. Dessa primater har emellertid den största potentialen för studier av mänsklig (pato) fysiologisk neocortexutveckling och dess utveckling. En lösning på detta dilemma är att tillämpa elektroporeringstekniken på primathjärnorganoider28.
Detta dokument presenterar ett protokoll för elektroporering av en subtyp av primathjärnorganoider, primatcerebrala organoider. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb och kostnadseffektiv genetisk modifiering av cellpopulationer inom organoidernas ventrikelliknande strukturer. Specifikt beskriver vi ett enhetligt protokoll för generering av primatcerebrala organoider från humana (Homo sapiens), schimpanser (Pan troglodytes), rhesusmakak (Macaca mulatta) och vanlig marmoset (Callithrix jacchus) iPSCs. Dessutom beskriver vi mikroinjektions- och elektroporeringstekniken i detalj och tillhandahåller “go” och “no-go” kriterier för att utföra primatcerebral organoid elektroporering. Detta tillvägagångssätt är ett effektivt verktyg för att studera (pato) fysiologisk neocortexutveckling och dess utveckling i en modell särskilt nära den mänskliga situationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De procedurer som beskrivs här representerar ett enhetligt protokoll för generering av cerebrala organoider från olika primatarter med en riktad elektroporeringsmetod. Detta möjliggör ektopiskt uttryck av en GOI i ett modellsystem som emulerar primat (inklusive mänsklig) (pato) fysiologisk neocortexutveckling. Detta enhetliga protokoll för generering av primatcerebrala organoider använder samma material (t.ex. media) och protokollsteg för alla fyra primatarter som presenteras. Utvecklingsskillnader mellan dessa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ber om ursäkt till alla forskare vars arbete inte kunde citeras på grund av utrymmesbegränsningar. Vi tackar Ulrich Bleyer från de tekniska tjänsterna vid DPZ och Hartmut Wolf från verkstaden vid MPI-CBG för konstruktionen av petriskålelektrodkamrarna; Stoyan Petkov och Rüdiger Behr för tillhandahållande av humana (iLonza2.2), rhesusmakak (iRh33.1) och marmoset (cj_160419_5) iPSCs; Sabrina Heide för kryosektion och immunofluorescensfärgning; och Neringa Liutikaite och César Mateo Bastidas Betancourt för kritisk läsning av manuskriptet. Arbetet i W.B.H.:s laboratorium stöddes av ett ERA-NET NEURON (MicroKin) bidrag. Arbetet i M.H:s laboratorium stöddes av ett ERC Starting Grant (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. 발생학. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
