Dette manuskript beskriver en ny direkte planteinfusionsanordning til screening af molekylers effektivitet mod bakterierne (Candidatus Liberibacter asiaticus) eller dens insektvektor (Diaphorina citri, Kuwayama), der i kombination er forbundet med Huanglongbing citrussygdom.
Test af terapeutiske forbindelsers funktion i planter er en vigtig bestanddel af landbrugsforskningen. Blad- og jorddrenchmetoder er rutinemæssige, men har ulemper, herunder variabel optagelse og miljømæssig nedbrydning af testede molekyler. Trunkinjektion af træer er veletableret, men de fleste metoder til dette kræver dyrt, proprietært udstyr. For at screene forskellige behandlinger for Huanglongbing er der behov for en simpel, billig metode til at levere disse forbindelser til vaskulært væv af små drivhusdyrkede citrustræer inficeret med den floembegrænsede bakterie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) eller inficeret med floem-fodring CLas insektvektor Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) er nødvendig.
For at opfylde disse screeningskrav blev der designet en direkte planteinfusion (DPI) enhed, der forbinder til plantens bagagerum. Enheden er lavet ved hjælp af et nylonbaseret 3D-printsystem og let tilgængelige hjælpekomponenter. Denne enheds evne til optagelse af forbindelser blev testet i citrusplanter ved hjælp af fluorescerende markør 5,6-carboxyfluorescein-diacetat. Ensartet sammensat fordeling af markøren gennem planterne blev rutinemæssigt observeret.
Desuden blev denne enhed brugt til at levere antimikrobielle og insekticide molekyler for at bestemme deres virkninger på henholdsvis CLas og D. citri. Aminoglycosidantibiotika streptomycin blev leveret til CLas-inficerede citrusplanter ved hjælp af enheden, hvilket resulterede i en reduktion i CLas-titeren fra 2 uger til 4 uger efter behandling. Levering af det neonicotinoid insekticid imidacloprid i D. citri-inficerede citrusplanter resulterede i en signifikant stigning i psylliddødeligheden efter 7 dage. Disse resultater tyder på, at denne DPI-enhed repræsenterer et nyttigt system til levering af molekyler i planter til test og lette forsknings- og screeningsformål.
Forvaltningen af planter i kommercielle og landskabsmæssige omgivelser kræver ofte brug af kemiske forbindelser for at optimere plantevækst og sundhed. Hvordan disse molekyler leveres afhænger af typen af molekyle, molekylets funktion, typen af plante og det eksisterende styringssystem. Blad- og jordapplikationer er de nemmeste leveringsstrategier, men begrænsninger i optagelsen af nogle molekyler kræver direkte levering. Et eksempel på disse molekyler er terapeutiske molekyler, der fungerer bedst, når de bevæger sig systemisk i planten, men ikke effektivt kan leveres ved enkle topiske applikationer1. Dette er tilfældet med Huanglongbing (HLB), også kaldet citrusgrønning sygdom. HLB er en sygdom forbundet med en floembegrænset bakterie, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), som ikke kan dyrkes uden for planten, eller dens insektvektor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Hvis de formodede terapeutiske molekyler er genprodukter, kan de testes ved at skabe transgene planter, der udtrykker disse forbindelser. Transgen planteproduktion kan imidlertid være tids- og ressourcekrævende, er meget genotypeafhængig og kan hæmmes af genhæmning3. Selv om disse transgene stoffer viser lovende resultater, reducerer lovgivningsmæssige og offentlige opfattelsesbegrænsninger sandsynligheden for deres kommercielle accept 4,5. Den eksogene anvendelse af forbindelser forenkler imidlertid testningen af biologiske og syntetiske molekyler, fordi det ikke kræver produktion af stabile eller forbigående ekspressive transgene planter, hvilket reducerer tid og ressourcer til at teste et molekyles virkninger. En metode til effektiv systemisk planteafgivelse af eksogene forbindelser kan anvendes til en lang række forsknings- og screeningsformål.
En af disse anvendelser er analysen af systemisk molekylebevægelse i en plantes vaskulære system, hvilket kan gøres ved hjælp af sporbare markører, uanset om de er fluorescerende, synlige eller unikke kemiske isotoper 6,7,8,9. En almindeligt anvendt fluorescerende markør er 5,6-carboxyfluorescein-diacetat (CFDA), som er et membrangennemtrængeligt farvestof, der nedbrydes af intracellulære esteraser til 5,6-carboxyfluorescein (CF) og derefter bliver fluorescerende og membranuigennemtrængelig10. CFDA er blevet flittigt brugt til at overvåge floemtransport, synke- og kildeforhold og vaskulaturmønster i plantevæv11,12.
Ud over disse markører kan visse forbindelser direkte ændre plantens fysiologi for at øge produktiviteten eller dræbe planten i tilfælde af herbicider. Både insekticider og antimikrobielle forbindelser er et middel til at øge planteproduktiviteten, især i nærvær af HLB. Et eksempel på et antimikrobielt molekyle, der bruges til at kontrollere CLas, er streptomycin. Streptomycin er et aminoglycosidantibiotikum, der oprindeligt blev isoleret fra Streptomyces griseus og har vist sig at hæmme bakterievækst gennem hæmning af proteinbiosyntese13. Med hensyn til insekticider er hovedmålet for HLB-forskning D. citri, som overfører CLas fra træ til træ14. Til dette formål anvendes neonicotinoider, såsom imidacloprid, almindeligt, da de er guldstandarden til bekæmpelse af skadedyr15. Alle disse forskellige anvendelser er vigtige aspekter af de nuværende planteforvaltningsstrategier, og udviklingen af nye produkter afhænger af effektive screeningsanalyser.
En metode, der anvendes til introduktion af forbindelser i træagtige planter, er direkte injektion i bagagerummet. Der er designet en række systemer, der varierer i deres behov for forborede injektionssteder, og disse systemer bruger enten trykbaseret injektion eller passivt flow16. Selvom trykbaserede systemer giver mulighed for hurtig introduktion af en given forbindelse, skal den potentielle fysiske skade forårsaget af at tvinge væske gennem blokeret eller emboliseret vaskulatur overvejes17. Selv om blad- eller gennemføringsmidler af forbindelser er mindre tidskrævende at gennemføre, reducerer direkte planteinjektion spild af forbindelsen af interesse på grund af tab til luft eller jord og kan også forlænge den tid, forbindelserne er i aktiv tilstand, ved at reducere eksponeringen for det ydre miljø18. Begge disse aspekter er vigtige for at bevare dyre reagenser og sikre konsistens blandt replikater i forskningsmiljøer.
Denne undersøgelse beskriver design, konstruktion og anvendelse af en innovativ DPI-enhed (Direct Plant Infusion), som kan bruges til at vurdere, hvordan forbindelser af interesse påvirker en værtsplante. En standard 3D-printer blev brugt til at fremstille både selve enheden og flere komponenter i forbindelse med dens konstruktion. Denne interne konstruktionsmetode giver forskere mulighed for at ændre enheden og enhedskomponenterne baseret på deres specifikke eksperimentelle behov og reducerer afhængigheden af kommercielt tilgængelige planteinjektionsanordninger. Enhedsopsætningen er enkel og effektiv, og alle hjælpekomponenter er let tilgængelige og billige. Selvom systemet blev designet til brug med en række plantearter, vedrører eksemplerne her pottecitrusplanter. Derudover viser denne undersøgelse, at denne enhed er i stand til effektivt at levere flere typer forbindelser systemisk til unge citrusplanter uden at forårsage dødelighed. De testede forbindelser omfattede CFDA, som blev brugt til at vurdere stoffordelingen i planten, og streptomycin og imidacloprid, som blev brugt til at verificere, at de antimikrobielle og insekticide virkninger af disse forbindelser blev observeret, når de blev leveret via DPI.
For at DPI-enheden kan betragtes som en levedygtig metode til eksogen levering af forbindelser til planter, skal den bidrage til robust og konsistent stofoptagelse i en række vævstyper. Eksperimentet ved hjælp af CFDA viste tydeligt både acropetal og basipetal sammensat bevægelse såvel som i både vaskulærsystemet og mesofylcellerne i bladet. Derudover, og formodentlig fordi det borede hul, der anvendes i denne DPI-enhed, giver en stor mængde overfladeareal til sammensat optagelse, var CFDA til stede i relativt lige store mængder i alle sektioner af stammen, ikke kun i en lille delmængde af vaskulaturen ved siden af enheden, som det er set i tidligere farvestofoptagelsesundersøgelser i planter, der bruger trunkinjektion6. Derudover blev leveringen af grønt fluorescerende protein og blomsterfarvestof testet ved hjælp af DPI-enheden, og en fordeling af disse forbindelser svarende til CFDA blev observeret (data ikke vist). Disse data tyder på, at enheden kan bruges til systemisk at levere en række forbindelser, der varierer i størrelse og molekylær struktur. Det er dog værd at bemærke, at der var forskelle i den sammensatte optagelse baseret på bladudviklingsstadiet, hvor yngre udviklende blade optager mere sammensatte end ældre etablerede blade. Dette kan skyldes ændringerne i vaskens egenskaber i vasken versus kildevævet og bør optimeres til et givet eksperiment.
DPI-enheden viste tilstrækkelig sammensat optagelse til visualisering af CFDA, GFP og blomsterfarvestof, og det tog også nok op til at vise de antibakterielle og insekticide virkninger af henholdsvis streptomycin og imidacloprid. Begge disse forbindelser resulterede i ændringer i målorganismens levedygtighed 1 uge efter en enkelt 2,0 ml behandling. Disse data tyder på, at DPI-enheden kan anvendes i analyser af hele planter til at teste levedygtigheden af en lang række forbindelser til bekæmpelse af mikrobielle og skadedyr. På grund af sin direkte kontakt med vaskulærsystemet kan denne enhed endda give mulighed for at teste forbindelser, der ikke effektivt optages af rødderne eller epidermale celler. Af særlig interesse ville være RNA-interferens (RNAi), da dette kunne bruges til at modulere genekspressionen i værtsplanten, patogenet eller patogenvektoren. Tidligere forskning, der introducerede hårnåle-RNA gennem et boret hul i stammen af æble- og drueplanter, viste, at RNA-molekylerne var begrænset til xylemvævet, hvilket tyder på, at disse molekyler kun kan være effektive mod tygge- og xylemsaftfødende organismer22. I betragtning af at DPI-enheden bruger et lignende leveringssystem til borede huller, er det indlysende, at hårnåle-RNA, der leveres med denne enhed, også kan være begrænset til xylemvævet. Det observerede fald i titeren af den floembegrænsede CLas efter streptomycinbehandling fra DPI-enheden tyder imidlertid stærkt på, at dette antibiotikum var til stede i floem. Derfor er det sandsynligt, at den vaskulære fordeling af de forbindelser, der leveres ved hjælp af DPI-enheden, afhænger af deres størrelse og kemi, og hvert molekyle skal evalueres individuelt.
Selvom der findes en række kommercielt tilgængelige DPI-enheder på markedet, kan den enhed, der beskrives her, fremstilles internt og kan ændres. På denne måde kan forbedringer og ændringer i størrelse foretages baseret på den planteart og det eksperimentelle design, der anvendes, og det er ikke afhængigt af kommercielle produkter. Derudover er enheden semi-permanent fastgjort til planten, hvilket betyder, at flere behandlinger af en given forbindelse kan udføres samtidigt uden at skulle skade planten igen med flere sammensatte injektioner. På en advarsel kan enheden lække, hvis den ikke er installeret korrekt. Som følge heraf går forbindelsen tabt for miljøet i stedet for at blive leveret til anlægget. Derfor skal man sørge for at inspicere enheden for tegn på lækage under opsætningen og de første par dage bagefter. Selvom boring af et hul i træet er potentielt skadeligt, blev denne metode valgt for at sikre robust og ensartet stofoptagelse. Derudover blev der ikke set nogen negative virkninger på plantesundheden fra fastgørelsen af DPI-enheden i disse forsøg. Imidlertid bør ekstra planter inkluderes i forsøgsdesignet for at erstatte dem, der kan miste kraft i løbet af et givet forsøg. Endelig, da denne enhed bruger passiv strømning til at introducere forbindelser, kan det være vanskeligt at forudsige optagelseshastigheden på tværs af forskellige plantearter eller udviklingsstadier af den samme art. Dette kan komplicere eksperimenter, hvis hastigheden af optagelsen af forbindelser er en begrænsende faktor. For de bedste resultater skal eksperimenter planlægges, så der gives tilstrækkelig tid til, at planten fuldt ud absorberer 2,5 ml forbindelse, hvilket kan tage op til 1 uge. Afslutningsvis er denne DPI-enhed et effektivt værktøj til hurtig evaluering af antimikrobielle eller insekticide forbindelsers in planta-aktivitet mod CLas og dens vektor, D. citri, hvilket giver mere information om den systemiske effektivitet og indflydelse på plantens ydeevne end den tidligere præsenterede løsrevne bladanalyse23. Uden tvivl når de mange forskellige applikationer til dette system langt ud over de specifikke anvendelser, der er beskrevet i denne undersøgelse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Mant Acon for de planter, der anvendes i denne undersøgelse. Finansieringen blev ydet af US Department of Agriculture (USDA) CRIS-projekt 8062-22410-007-000-D og USDA NIFA-tilskud 2020-70029-33176.
0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
Parafilm | Bemis | HS234526A | |
Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |