यह पांडुलिपि बैक्टीरिया (कैंडिडाटस लिबिबैक्टर एशियाटिकस) या इसके कीट वेक्टर (डायफोरिना सिट्री, कुवायामा) के खिलाफ अणुओं की प्रभावशीलता की जांच के लिए एक नए प्रत्यक्ष पौधे जलसेक उपकरण का वर्णन करती है, जो संयोजन में, हुआंगलोंगबिंग साइट्रस रोग से जुड़े हैं।
पौधों में चिकित्सीय यौगिकों के कार्य का परीक्षण कृषि अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण घटक है। पर्ण और मिट्टी-ड्रेंच विधियां नियमित हैं, लेकिन इसमें कमियां हैं, जिनमें परिवर्तनीय उत्थान और परीक्षण किए गए अणुओं का पर्यावरणीय टूटना शामिल है। पेड़ों के ट्रंक इंजेक्शन अच्छी तरह से स्थापित है, लेकिन इसके लिए अधिकांश तरीकों को महंगे, मालिकाना उपकरण की आवश्यकता होती है। हुआंगलोंगबिंग के लिए विभिन्न उपचारों की जांच करने के लिए, फ्लोएम-सीमित जीवाणु कैंडिडाटस लिबिबैक्टर एशियाटिकस (सीएलए) से संक्रमित छोटे ग्रीनहाउस-विकसित साइट्रस पेड़ों के संवहनी ऊतक में इन यौगिकों को पहुंचाने के लिए एक सरल, कम लागत वाली विधि की आवश्यकता होती है या फ्लोएम-फीडिंग सीएलएएस कीट वेक्टर डायफोरिना सिट्री कुवायामा (डी सिट्री) से संक्रमित होता है।
इन स्क्रीनिंग आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, एक प्रत्यक्ष संयंत्र जलसेक (डीपीआई) उपकरण डिजाइन किया गया था जो पौधे के ट्रंक से जुड़ता है। डिवाइस एक नायलॉन-आधारित 3 डी-प्रिंटिंग सिस्टम और आसानी से उपलब्ध सहायक घटकों का उपयोग करके बनाया गया है। इस उपकरण की यौगिक अपटेक प्रभावकारिता का परीक्षण साइट्रस पौधों में फ्लोरोसेंट मार्कर 5,6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन-डायसेटेट का उपयोग करके किया गया था। पूरे पौधों में मार्कर का एक समान यौगिक वितरण नियमित रूप से देखा गया था।
इसके अलावा, इस उपकरण का उपयोग क्रमशः सीएलए और डी सिट्री पर उनके प्रभाव ों को निर्धारित करने के लिए रोगाणुरोधी और कीटनाशक अणुओं को वितरित करने के लिए किया गया था। एमिनोग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक स्ट्रेप्टोमाइसिन को डिवाइस का उपयोग करके सीएलएएस-संक्रमित साइट्रस पौधों में वितरित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप उपचार के बाद 2 सप्ताह से 4 सप्ताह तक सीएलएएस टिटर में कमी आई थी। सिट्री-संक्रमित साइट्रस पौधों में नियोनिकोटिनॉइड कीटनाशक इमिडाक्लोप्रिड पहुंचाने के परिणामस्वरूप 7 दिनों के बाद प्सिलिड मृत्यु दर में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। इन परिणामों से पता चलता है कि यह डीपीआई डिवाइस परीक्षण के लिए पौधों में अणुओं को पहुंचाने और अनुसंधान और स्क्रीनिंग उद्देश्यों की सुविधा के लिए एक उपयोगी प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है।
वाणिज्यिक और परिदृश्य सेटिंग्स में पौधों के प्रबंधन के लिए अक्सर पौधे के विकास और स्वास्थ्य को अनुकूलित करने के लिए रासायनिक यौगिकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इन अणुओं को कैसे वितरित किया जाता है, यह अणु के प्रकार, अणु के कार्य, पौधे के प्रकार और प्रबंधन प्रणाली पर निर्भर करता है। पर्ण और मिट्टी के अनुप्रयोग सबसे आसान वितरण रणनीतियाँ हैं, लेकिन कुछ अणुओं के उत्थान में सीमाओं के लिए प्रत्यक्ष वितरण की आवश्यकता होती है। इन अणुओं का एक उदाहरण चिकित्सीय अणु हैं जो सबसे अच्छा कार्य करते हैं जब वे पौधे के भीतर व्यवस्थित रूप से चलते हैं लेकिन सरलसामयिक अनुप्रयोगों द्वारा प्रभावी ढंग से वितरित नहीं किए जा सकते हैं। यह हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) के साथ मामला है, जिसे साइट्रस ग्रीनिंग रोग भी कहा जाता है। एचएलबी एक फ्लोएम-सीमित जीवाणु, कैंडिडाटस लिबिबैक्टर एशियाटिकस (सीएलएएस) से जुड़ी एक बीमारी है, जिसे पौधे के बाहर संवर्धित नहीं किया जा सकता है, या इसके कीट वेक्टर, डायफोरिना सिट्री कुवायामा (डी।
यदि कथित चिकित्सीय अणु जीन उत्पाद हैं, तो इन यौगिकों को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक पौधों को बनाकर उनका परीक्षण किया जा सकता है। हालांकि, ट्रांसजेनिक पौधे का उत्पादन समय-और संसाधन-गहन हो सकता है, अत्यधिक जीनोटाइप-निर्भर है, और जीन साइलेंसिंग3 द्वारा बाधित किया जा सकता है। इसके अलावा, भले ही ये ट्रांसजेनिक आशाजनक परिणाम दिखाते हैं, नियामक और सार्वजनिक धारणा की बाधाएं उनकीवाणिज्यिक स्वीकृति की संभावना को कम करती हैं। हालांकि, यौगिकों का बहिर्जात अनुप्रयोग जैविक और सिंथेटिक अणुओं के परीक्षण को सरल बनाता है क्योंकि इसे स्थिर या क्षणिक रूप से व्यक्त ट्रांसजेनिक पौधों के उत्पादन की आवश्यकता नहीं होती है, जो अणु के प्रभावों के परीक्षण के लिए समय और संसाधनों को कम करता है। बहिर्जात यौगिकों के प्रभावी और कुशल प्रणालीगत संयंत्र वितरण के लिए एक विधि का उपयोग विभिन्न प्रकार के अनुसंधान और स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है।
इन अनुप्रयोगों में से एक पौधे की संवहनी प्रणाली के भीतर प्रणालीगत अणु आंदोलन का विश्लेषण है, जिसे ट्रैक करने योग्य मार्करों का उपयोग करके किया जा सकता है, चाहे वे फ्लोरोसेंट, दृश्यमान या अद्वितीय रासायनिक आइसोटोप 6,7,8,9 हों। आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला फ्लोरोसेंट मार्कर 5,6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन-डायसेटेट (सीएफडीए) है, जो एक झिल्ली-पारगम्य डाई है जो इंट्रासेल्युलर एस्टरेज़ द्वारा 5,6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन (सीएफ) में अवक्रमित होता है और बाद में, फ्लोरोसेंट और झिल्ली-अभेद्य10 बन जाता है। सीएफडीए का उपयोग फ्लोएम परिवहन, सिंक और स्रोत संबंधों और पौधे के ऊतकों11,12 में वाहिका पैटर्न की निगरानी के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है।
इन मार्करों के अलावा, कुछ यौगिक उत्पादकता बढ़ाने के लिए पौधे के शरीर विज्ञान को सीधे बदल सकते हैं या जड़ी-बूटियों के मामले में पौधे को मार सकते हैं। कीटनाशक और रोगाणुरोधी यौगिक दोनों पौधे की उत्पादकता बढ़ाने का एक साधन हैं, खासकर एचएलबी की उपस्थिति में। एक रोगाणुरोधी अणु का एक उदाहरण जिसका उपयोग सीएलए को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है, स्ट्रेप्टोमाइसिन है। स्ट्रेप्टोमाइसिन एक एमिनोग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक है जिसे मूल रूप से स्ट्रेप्टोमाइसेस ग्रिसस से अलग किया गया था और प्रोटीन बायोसिंथेसिस13 के निषेध के माध्यम से बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए दिखाया गया है। कीटनाशकों के संदर्भ में, एचएलबी अनुसंधान के लिए मुख्य लक्ष्य डी सिट्री है, जो सीएलए को पेड़ से पेड़14 तक पहुंचाता है। इस उद्देश्य के लिए, नियोनिकोटिनोइड्स, जैसे कि इमिडाक्लोप्रिड, आमतौर पर उपयोग किए जाते हैं, क्योंकि वे कीट कीटों को नियंत्रित करने के लिए स्वर्ण मानकहैं। ये सभी विविध उपयोग वर्तमान संयंत्र प्रबंधन रणनीतियों के महत्वपूर्ण पहलू हैं, और नए उत्पादों का विकास कुशल स्क्रीनिंग परख पर निर्भर है।
लकड़ी के पौधों में यौगिकों की शुरूआत के लिए उपयोग की जाने वाली एक विधि ट्रंक में सीधे इंजेक्शन है। विभिन्न प्रकार की प्रणालियों को डिजाइन किया गया है जो प्रीड्रिल इंजेक्शन साइटों के लिए उनकी आवश्यकताओं में भिन्न होते हैं, और ये सिस्टम दबाव-आधारित इंजेक्शन या निष्क्रिय प्रवाह16 का उपयोग करते हैं। यद्यपि दबाव-आधारित प्रणालियां किसी दिए गए यौगिक के त्वरित परिचय की अनुमति देती हैं, अवरुद्ध या एम्बोलाइज्ड वास्कुलचर के माध्यम से तरल को मजबूर करने के कारण होने वाली संभावित शारीरिक क्षतिपर विचार करने की आवश्यकता है। यद्यपि यौगिकों के पर्ण या ड्रेंच अनुप्रयोग को लागू करने के लिए कम समय-गहन है, प्रत्यक्ष पौधे इंजेक्शन हवा या मिट्टी को नुकसान के कारण ब्याज के यौगिक की बर्बादी को कम करता है औरबाहरी वातावरण के संपर्क को कम करके यौगिकों के सक्रिय अवस्था में होने के समय को भी लंबा कर सकता है। ये दोनों पहलू महंगे अभिकर्मकों को संरक्षित करने और अनुसंधान सेटिंग्स में प्रतिकृति के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
यह अध्ययन एक अभिनव प्रत्यक्ष संयंत्र जलसेक (डीपीआई) उपकरण के डिजाइन, निर्माण और उपयोग का वर्णन करता है, जिसका उपयोग यह आकलन करने के लिए किया जा सकता है कि रुचि के यौगिक मेजबान पौधे को कैसे प्रभावित करते हैं। एक मानक 3 डी प्रिंटर का उपयोग डिवाइस और इसके निर्माण से जुड़े कई घटकों दोनों के निर्माण के लिए किया गया था। यह इन-हाउस निर्माण विधि शोधकर्ताओं को उनकी विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर डिवाइस और डिवाइस घटकों को संशोधित करने की अनुमति देती है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पौधे इंजेक्शन उपकरणों पर निर्भरता को कम करती है। डिवाइस सेटअप सरल और कुशल है, और सभी सहायक घटक आसानी से उपलब्ध और सस्ती हैं। यद्यपि प्रणाली को विभिन्न प्रकार के पौधों की प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया था, यहां प्रस्तुत उदाहरण गमले वाले साइट्रस पौधों से संबंधित हैं। इसके अतिरिक्त, यह अध्ययन दर्शाता है कि यह उपकरण घातकता पैदा किए बिना युवा साइट्रस पौधों को व्यवस्थित रूप से कई प्रकार के यौगिकों को कुशलतापूर्वक वितरित करने में सक्षम है। परीक्षण किए गए यौगिकों में सीएफडीए शामिल था, जिसका उपयोग पौधे में यौगिक वितरण का आकलन करने के लिए किया गया था, और स्ट्रेप्टोमाइसिन और इमिडाक्लोप्रिड, जिसका उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया गया था कि डीपीआई के माध्यम से वितरित होने पर इन यौगिकों के रोगाणुरोधी और कीटनाशक प्रभाव देखे गए थे।
डीपीआई डिवाइस को पौधों में बहिर्जात यौगिक वितरण के लिए एक व्यवहार्य विधि माना जाता है, इसे विभिन्न प्रकार के ऊतक प्रकारों में मजबूत और सुसंगत यौगिक उत्थान में योगदान देना चाहिए। सीएफडीए का उपयोग करने वाले प्रयोग ने स्पष्ट रूप से एक्रोपेटल और बेसिपेटल यौगिक आंदोलन दोनों को दिखाया, साथ ही साथ पत्ती के संवहनी प्रणाली और मेसोफिल कोशिकाओं दोनों में भी। इसके अतिरिक्त, और संभवतः क्योंकि इस डीपीआई डिवाइस में उपयोग किया जाने वाला ऊब छेद यौगिक उत्थान के लिए बड़ी मात्रा में सतह क्षेत्र प्रदान करता है, सीएफडीए स्टेम के सभी वर्गों में अपेक्षाकृत समान मात्रा में मौजूद था, न कि केवल डिवाइस से सटे वाहिका के एक छोटे उप-समूह में, जैसा कि ट्रंक इंजेक्शन6 का उपयोग करके पौधों में पिछले डाई अपटेक अध्ययनों में देखा गया है।. इसके अतिरिक्त, डीपीआई डिवाइस का उपयोग करके हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और पुष्प डाई के वितरण का परीक्षण किया गया था, और सीएफडीए के समान इन यौगिकों का वितरण देखा गया था (डेटा नहीं दिखाया गया था)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि डिवाइस का उपयोग विभिन्न प्रकार के यौगिकों को व्यवस्थित रूप से वितरित करने के लिए किया जा सकता है जो आकार और आणविक संरचना में भिन्न होते हैं। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि पत्ती के विकास के चरण के आधार पर यौगिक उत्थान में अंतर थे, जिसमें युवा विकासशील पत्तियां पुरानी स्थापित पत्तियों की तुलना में अधिक यौगिक लेती हैं। यह सिंक बनाम स्रोत ऊतक में मौजूद वाहिका गुणों में परिवर्तन के कारण हो सकता है और किसी दिए गए प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
डीपीआई डिवाइस ने सीएफडीए, जीएफपी और फ्लोरल डाई के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए पर्याप्त यौगिक उत्थान दिखाया, और इसने क्रमशः स्ट्रेप्टोमाइसिन और इमिडाक्लोप्रिड के जीवाणुरोधी और कीटनाशक प्रभाव दिखाने के लिए पर्याप्त लिया। इन दोनों यौगिकों के परिणामस्वरूप एकल 2.0 एमएल उपचार के 1 सप्ताह बाद लक्ष्य जीव व्यवहार्यता में परिवर्तन हुआ। इन आंकड़ों से पता चलता है कि डीपीआई डिवाइस का उपयोग माइक्रोबियल और कीट कीटों के नियंत्रण के लिए विभिन्न प्रकार के यौगिकों की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए पूरे पौधे के परख में किया जा सकता है। इसके अलावा, संवहनी प्रणाली के साथ इसके सीधे संपर्क के कारण, यह उपकरण उन यौगिकों का परीक्षण करने का अवसर भी प्रदान कर सकता है जो जड़ों या एपिडर्मल कोशिकाओं द्वारा कुशलता से नहीं लिए जाते हैं। विशेष रुचि आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) होगी, क्योंकि इसका उपयोग मेजबान पौधे, रोगज़नक़ या रोगज़नक़ वेक्टर के भीतर जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है। सेब और अंगूर के पौधों के ट्रंक में ड्रिल किए गए छेद के माध्यम से हेयरपिन आरएनए पेश करने वाले पिछले शोध से पता चला है कि आरएनए अणु जाइलम ऊतक तक ही सीमित थे, यह सुझाव देते हुए कि ये अणु केवल चबाने और जाइलम सैप-फीडिंग जीवों के खिलाफ प्रभावी हो सकतेहैं। यह देखते हुए कि डीपीआई डिवाइस एक समान ड्रिल-होल डिलीवरी सिस्टम का उपयोग करता है, यह कारण है कि इस डिवाइस के साथ वितरित हेयरपिन आरएनए भी जाइलम ऊतक तक सीमित हो सकता है। हालांकि, डीपीआई डिवाइस से स्ट्रेप्टोमाइसिन उपचार के बाद फ्लोएम-सीमित सीएलए के टिटर में देखी गई कमी दृढ़ता से बताती है कि यह एंटीबायोटिक फ्लोएम में मौजूद था। इसलिए, यह संभावना है कि डीपीआई डिवाइस का उपयोग करके वितरित यौगिकों का संवहनी वितरण उनके आकार और रसायन विज्ञान पर निर्भर है, और प्रत्येक अणु का मूल्यांकन व्यक्तिगत आधार पर किया जाना चाहिए।
यद्यपि बाजार पर कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीपीआई डिवाइस उपलब्ध हैं, यहां वर्णित डिवाइस को इन-हाउस निर्मित किया जा सकता है और यह परिवर्तनीय है। इस तरह, पौधों की प्रजातियों और प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर आकार में सुधार और परिवर्तन किए जा सकते हैं, और यह वाणिज्यिक उत्पादों पर निर्भर नहीं है। इसके अलावा, डिवाइस पौधे से अर्ध-स्थायी रूप से जुड़ा हुआ है, जिसका अर्थ है कि किसी दिए गए यौगिक के कई उपचार कई यौगिक इंजेक्शन के साथ पौधे को घायल किए बिना समवर्ती रूप से किए जा सकते हैं। सावधानी बरतने पर, ठीक से स्थापित नहीं होने पर डिवाइस लीक हो सकता है। नतीजतन, यौगिक पौधे को वितरित करने के बजाय पर्यावरण के लिए खो जाता है। इसलिए, सेटअप के दौरान और पहले कुछ दिनों के बाद रिसाव के किसी भी संकेत के लिए डिवाइस का निरीक्षण करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। हालांकि पेड़ में छेद ड्रिल करना संभावित रूप से हानिकारक है, इस विधि को मजबूत और लगातार यौगिक उत्थान सुनिश्चित करने के लिए चुना गया था। इसके अतिरिक्त, इन प्रयोगों में डीपीआई डिवाइस के लगाव से पौधे के स्वास्थ्य पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं देखा गया। हालांकि, अतिरिक्त पौधों को प्रयोगात्मक डिजाइन में शामिल किया जाना चाहिए ताकि उन लोगों को प्रतिस्थापित किया जा सके जो किसी दिए गए प्रयोग के दौरान शक्ति खो सकते हैं। अंत में, चूंकि यह उपकरण यौगिकों को पेश करने के लिए निष्क्रिय प्रवाह का उपयोग करता है, इसलिए विभिन्न पौधों की प्रजातियों या एक ही प्रजाति के विकास के चरणों में तेज की दर की भविष्यवाणी करना मुश्किल हो सकता है। यह प्रयोगों को जटिल कर सकता है यदि यौगिक उत्थान की गति एक सीमित कारक है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रयोगों की योजना बनाई जानी चाहिए ताकि पौधे को 2.5 एमएल यौगिक को पूरी तरह से अवशोषित करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान किया जाए, जिसमें 1 सप्ताह तक का समय लग सकता है। अंत में, यह डीपीआई डिवाइस सीएलएएस और इसके वेक्टर, डी सिट्री के खिलाफ रोगाणुरोधी या कीटनाशक यौगिकों की इनप्लांटा गतिविधि के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक प्रभावी उपकरण है, इस प्रकार पहले प्रस्तुत अलग पत्ती परख23 की तुलना में पौधे के प्रदर्शन पर प्रणालीगत प्रभावशीलता और प्रभाव पर अधिक जानकारी प्रदान करता है। निस्संदेह, इस प्रणाली के लिए अनुप्रयोगों की विविधता इस अध्ययन में वर्णित विशिष्ट उपयोगों से परे अच्छी तरह से पहुंचती है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस अध्ययन में उपयोग किए गए पौधों के लिए मांट एकॉन को धन्यवाद देना चाहते हैं। वित्त पोषण अमेरिकी कृषि विभाग (यूएसडीए) सीआरआईएस परियोजना 8062-22410-007-000-डी और यूएसडीए एनआईएफए अनुदान 2020-70029-33176 द्वारा प्रदान किया गया था।
0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
Parafilm | Bemis | HS234526A | |
Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |