Isolierung und Kultivierung von primären Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem Arthritisgewebe
Summary
Die vorliegende Studie bietet ein modifiziertes Protokoll zur Isolierung von Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem entzündlichem Arthritisgewebe.
Abstract
Rheumatoide Arthritis ist eine Autoimmunerkrankung, die zu chronischen Entzündungen der Gelenke führt. Synovialmakrophagen und synoviale Fibroblasten spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis. Es ist wichtig, die Funktionen beider Zellpopulationen zu verstehen, um die Mechanismen aufzudecken, die dem pathologischen Fortschreiten und der Remission bei entzündlicher Arthritis zugrunde liegen. Im Allgemeinen sollten In-vitro-Versuchsbedingungen die In-vivo-Umgebung so weit wie möglich nachahmen. Aus dem Primärgewebe gewonnene Zellen wurden in Experimenten zur Charakterisierung von Synovialfibroblasten bei Arthritis verwendet. Im Gegensatz dazu wurden in Experimenten, in denen die biologischen Funktionen von Makrophagen bei entzündlicher Arthritis untersucht wurden, Zelllinien, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen und aus Blutmonozyten gewonnene Makrophagen verwendet. Es ist jedoch unklar, ob solche Makrophagen tatsächlich die Funktionen von geweberesidenten Makrophagen widerspiegeln. Um residente Makrophagen zu erhalten, wurden frühere Protokolle modifiziert, um sowohl primäre Makrophagen als auch Fibroblasten aus Synovialgewebe in einem Mausmodell für entzündliche Arthritis zu isolieren und zu expandieren. Diese primären Synovialzellen können für die In-vitro-Analyse von entzündlicher Arthritis nützlich sein.
Introduction
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch eine Hyperplasie der Synovialfunktion gekennzeichnet ist und zur Zerstörung der Gelenke führt 1,2. Geweberesidente Makrophagen und Fibroblasten sind in gesunden Synovialen vorhanden, um die gemeinsame Homöostase aufrechtzuerhalten. Bei RA-Patienten vermehren sich synoviale Fibroblasten (SFs), und Immunzellen, einschließlich Monozyten, infiltrieren in die Synovial- und Gelenkflüssigkeit, Prozesse, die mit Entzündungen verbundensind 1,3,4. Synoviale Makrophagen (SMs), zu denen residente Makrophagen und von Monozyten im peripheren Blut abgeleitete Makrophagen gehören, und SFs sind aberrant aktiviert und spielen eine wichtige Rolle in der RA-Pathogenese. Neuere Studien deuten darauf hin, dass Zell-Zell-Interaktionen zwischen SMs und SFs sowohl zur Exazerbation als auch zur Remission von RA 5,6 beitragen.
Um die RA-Pathogenese zu verstehen, wurden mehrere Nagetiermodelle der entzündlichen Arthritis verwendet, darunter K/BxN-Serumtransfer-Arthritis, Kollagen-induzierte Arthritis und Kollagen-Antikörper-induzierte Arthritis. Zellbasierte Assays sind in der Regel erforderlich, um molekulare Funktionen bei Arthritis zu klären. Daher wurden Primärzellen aus Tiermodellen der Arthritis isoliert. Die Methode zur Isolierung von SFs aus murinem Arthritisgewebe ist gut etabliert, und diese Zellen haben zur Aufklärung der molekularen Mechanismen in der Arthritis-Pathogenese beigetragen 7,8. Auf der anderen Seite wurden Makrophagen aus dem Knochenmark, aus Blutmonozyten gewonnene Makrophagen und Makrophagenzelllinien häufig als Makrophagenressourcen für Arthritisstudien verwendet 9,10. Da Makrophagen Funktionen erwerben können, die mit ihrer Mikroumgebung verbunden sind, fehlen den allgemeinen Quellen von Makrophagen möglicherweise die spezifischen Reaktionen auf Arthritisgewebe. Darüber hinaus ist es schwierig, durch Sortierung genügend Synovialzellen zu erhalten, da die murine Synovialflüssigkeit selbst in Arthritismodellen ein sehr kleines Gewebe ist. Die mangelnde Verwendung von Synovialmakrophagen für In-vitro-Studien war eine Einschränkung in Arthritisstudien. Die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung und Expansion von Synovialmakrophagen wäre ein Vorteil für die Aufklärung pathologischer Mechanismen bei RA.
Bei der vorherigen Methode zur Isolierung von SFs wurden SMs verworfen7. Darüber hinaus wurde über eine Methode zur Isolierung und Expansion residenter Makrophagen aus einigen Organen berichtet11. Daher wurden bestehende Protokolle in Kombination modifiziert. Die Modifikation zielt darauf ab, die Primärkultur sowohl von SMs als auch von SFs mit hoher Reinheit zu erreichen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, sowohl SMs als auch SFs aus murinem Arthritisgewebe zu isolieren und zu expandieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese hier entwickelte Methode verbessert frühere Techniken zur Isolierung sowohl von SFs aus muriner Arthritis als auch residenter Makrophagen aus einer Reihe von Organen 7,11. Die modifizierte Methode kann sowohl Makrophagen als auch Fibroblasten mit hoher Reinheit aus entzündlichen Synovialen isolieren, ist einfach und reproduzierbar. Da die Methode keine komplexen Instrumente wie einen Zellsortierer benötigt, kann sie von jedem durchgeführt werden. Darüb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für medizinische Forschungsunterstützung, dem Advanced Research Support Center (ADRES) und den Mitgliedern der Abteilung für integrative Pathophysiologie, Proteo-Science Center (PROS) der Universität Ehime, für ihre technische und hilfreiche Unterstützung. Diese Studie wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-Stipendien JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (an NS) und JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (an YI) unterstützt. Stipendien der Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, der Nakatomi Foundation, des Rising Stars Grant der Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR), der Sumitomo Foundation, der SENSHIN Medical Research Foundation, der Mochida Memorial Foundation (an NS); und ein Stipendium der Takeda Science Foundation für medizinische Forschung, ein Projektstipendium der UCB Japan (UCBJ) und das JSBMR Frontier Scientist Stipendium 2019 (für YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
References
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