Анализ флуоресцентно окрашенных липидных капель с 3D-реконструкцией для оценки стеатоза печени

Summary

Здесь мы демонстрируем оптимизированный протокол на основе флуоресценции BODIPY 493/503 для характеристики липидных капель в ткани печени. Благодаря использованию ортогональных проекций и 3D-реконструкций флуорофор позволяет успешно различать микровезикулярный и макровезикулярный стеатоз и может представлять собой дополнительный подход к классическим гистологическим протоколам оценки стеатоза печени.

Abstract

Липидные капли (LD) представляют собой специализированные органеллы, которые опосредуют накопление липидов и играют очень важную роль в подавлении липотоксичности и предотвращении дисфункции, вызванной свободными жирными кислотами (FA). Печени, учитывая ее критическую роль в жировом обмене организма, постоянно угрожает внутриклеточное накопление ЛД в виде как микровезикулярного, так и макровезикулярного стеатоза печени. Гистологическая характеристика LD обычно основана на жирорастворимых диазокрасителях, таких как окрашивание Oil Red O (ORO), но ряд недостатков постоянно препятствует использованию этого анализа с образцами печени. Совсем недавно липофильные флуорофоры 493/503 стали популярными для визуализации и определения местоположения LD из-за их быстрого поглощения и накопления в нейтральном ядре липидных капель. Несмотря на то, что большинство применений хорошо описаны в клеточных культурах, существует меньше доказательств, демонстрирующих надежное использование липофильных флуорофорных зондов в качестве инструмента визуализации LD в образцах тканей. Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол на основе дипиррометена бора (BODIPY) 493/503 для оценки LD в образцах печени из животной модели стеатоза печени, вызванного диетой с высоким содержанием жиров (HFD). Этот протокол охватывает подготовку образцов печени, срезы тканей, окрашивание BODIPY 493/503, получение изображений и анализ данных. Мы демонстрируем увеличение количества, интенсивности, соотношения площадей и диаметра печеночных ЛД при кормлении HFD. Используя ортогональные проекции и 3D-реконструкции, можно было наблюдать полное содержание нейтральных липидов в ядре LD, которые выглядели почти сферическими каплями. Кроме того, с помощью флуорофора BODIPY 493/503 мы смогли различить микровезикулы (1 мкм < d ≤ 3 мкм), промежуточные везикулы (3 мкм 9 мкм), что позволило успешно различать микровезикулярный и макровезикулярный стеатоз. В целом, этот протокол BODIPY 493/503 на основе флуоресценции является надежным и простым инструментом для характеристики ЛД печени и может представлять собой дополнительный подход к классическим гистологическим протоколам.

Introduction

Липидные капли (ЛД), классически рассматриваемые как энергетические депо, представляют собой специализированные клеточные органеллы, которые опосредуют накопление липидов, и они составляют гидрофобное нейтральное липидное ядро, которое в основном содержит сложные эфиры холестерина и триглицериды (ТГ), инкапсулированные фосфолипидным монослоем ^1,2,3.

Биогенез ЛД происходит в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), начиная с синтеза триацилглицерина (ТАГ) и эфиров стерола. Нейтральные липиды диффундируют между листочками бислоя ER в низких концентрациях, но сливаются в масляные линзы, которые растут и превращаются в почти сферические капли из мембраны ER, когда их внутриклеточная концентрация увеличивается⁴. Впоследствии белки из бислоя ER и цитозоля, особенно семейства белков перилипина (PLIN), перемещаются на поверхности LD, чтобы облегчить почкование ^5,6,7,8,9.

Благодаря синтезу новых жирных кислот и слиянию или слиянию LD LD вырастают до разных размеров. Соответственно, размер и количество LD значительно различаются в разных типах клеток. Мелкие капли (диаметром 300-800 нм), известные как начальные LD (iLDs), могут образовываться почти всеми клетками⁴. Позже при образовании LD большинство клеток способны превращать некоторые iLD в более крупные, расширяющиеся LD (eLDs >1 мкм в диаметре). Тем не менее, только определенные типы клеток, такие как адипоциты и гепатоциты, обладают способностью образовывать гигантские или сверхбольшие LD (до десятков микрон в диаметре)^4,10.

ЛД играют очень важную роль в регуляции клеточного липидного обмена, подавляя липотоксичность и предотвращая стресс ER, митохондриальную дисфункцию и, в конечном итоге, гибель клеток, вызванную свободными жирными кислотами (ЖК)^11,12,13,14. Кроме того, LD также участвуют в регуляции экспрессии генов, секвестрации белка репликации вируса, а также мембранного трафика и передачи сигналов^15,16,17. Таким образом, нарушение регуляции биогенеза ЛД является отличительной чертой хронических заболеваний, связанных с метаболическим синдромом, ожирением, сахарным диабетом 2 типа (СД2) и/или атеросклерозом, и это лишь некоторые из них^18,19,20.

Печень, как метаболический центр, в основном отвечает за липидный обмен путем хранения и переработки липидов, и, следовательно, ей постоянно угрожает липотоксичность²¹. Стеатоз печени (ГС) является общим признаком ряда прогрессирующих заболеваний печени и характеризуется чрезмерным внутриклеточным накоплением липидов в виде цитозольных ЛД, что, в конечном итоге, может привести к метаболической дисфункции печени, воспалению и запущенным формам неалкогольной жировой болезни печени^22,23,24,25. HS возникает, когда скорость окисления и экспорта жирных кислот в виде триглицеридов в липопротеинах очень низкой плотности (ЛПОНП) ниже, чем скорость поглощения жирных кислот печенью из плазмы и синтеза жирных кислот de novo ²⁶. Накопление липидов в печени часто происходит в двух формах – микровезикулярном и макровезикулярном стеатозе – и они проявляют различные цитоархитектонические характеристики²⁷. Как правило, микровезикулярный стеатоз характеризуется наличием небольших ЛД, рассеянных по всему гепатоциту с центральным расположением ядра, тогда как макровезикулярный стеатоз характеризуется наличием одного большого ЛД, который занимает большую часть гепатоцита, выталкивая ядро на периферию^28,29. Примечательно, что эти два типа стеатоза часто встречаются вместе, и остается неясным, как эти два паттерна LD влияют на патогенез заболевания, поскольку доказательства все еще противоречивы^31,32,33,34. Тем не менее, такой тип анализа часто используется в качестве «эталонного стандарта» в доклинических и клинических исследованиях для понимания динамического поведения LD и характеристики стеатоза печени 29,34,35,36.

Биопсия печени, золотой стандарт диагностики и классификации ГС, обычно оценивается с помощью гистологического анализа гематоксилина и эозина (H & E), где липидные капли оцениваются как неокрашенные вакуоли в окрашенных H&E срезах^{печени 37}. Хотя этот тип окрашивания приемлем для оценки макровезикулярного стеатоза, он обычно сужает оценку микровезикулярного стеатоза³⁸. Жирорастворимые диазокрасители, такие как Oil Red O (ORO), классически комбинируют с светлопольной микроскопией для анализа внутриклеточных запасов липидов, но они все еще имеют ряд недостатков: (i) использование этанола или изопропанола в процессе окрашивания, что часто вызывает разрушение нативных LD и случайное слияние, несмотря на то, что клетки фиксируются³⁹; (ii) трудоемкий характер, поскольку раствор ORO требует растворения и фильтрации свежего порошка из-за ограниченного срока годности, что способствует менее стабильным результатам; (iii) и тот факт, что ORO окрашивает не только липидные капли, но и часто переоценивает стеатоз печени³⁸.

Следовательно, проницаемые для клеток липофильные флуорофоры, такие как нильский красный, использовались либо в живых, либо в фиксированных образцах для преодоления некоторых из вышеупомянутых ограничений. Однако неспецифический характер маркировки клеточных липидных органелл неоднократно сужает оценки ЛД⁴⁰. Кроме того, спектральные свойства Nile Red изменяются в зависимости от полярности окружающей среды, что часто может приводить к спектральным сдвигам⁴¹.

Липофильный флуоресцентный зонд 1,3,5,7,8-пентаметил-4-бора-3а,4адиаза-с-индацен (длина волны возбуждения: 480 нм; максимум излучения: 515 нм; BODIPY 493/503) проявляет характеристики гидрофобности, которые позволяют быстро поглощать его внутриклеточными ЛД, накапливается в ядре липидных капель и, впоследствии, испускает ярко-зеленую флуоресценцию¹². В отличие от Nile Red, BODIPY 493/503 нечувствителен к полярности окружающей среды и, как было показано, более селективен, поскольку он демонстрирует высокую яркость для визуализации LD. Для окрашивания нейтральных LD этот краситель можно использовать в живых или фиксированных клетках и успешно сочетать с другими методами окрашивания и/или маркировки⁴². Еще одним преимуществом красителя является то, что он не требует особых усилий для помещения в раствор и является стабильным, что устраняет необходимость в его свежем приготовлении для каждого эксперимента⁴². Несмотря на то, что зонд BODIPY 493/503 был успешно использован для визуализации локализации и динамики LD в клеточных культурах, в некоторых отчетах также продемонстрировано надежное использование этого красителя в качестве инструмента визуализации LD в тканях, включая латеральную мышцу⁴³ человека, камбаловидную мышцу 42 крысы и кишечник⁴⁴ мыши.

Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол на основе BODIPY 493/503 в качестве альтернативного аналитического подхода для оценки числа, площади и диаметра LD в образцах печени из животной модели стеатоза печени. Эта процедура охватывает подготовку образцов печени, срез тканей, условия окрашивания, получение изображений и анализ данных.

Protocol

Все процедуры на животных, выполненные в этом исследовании, были одобрены Коимбрским институтом клинических и биомедицинских исследований (iCBR) и Органом по защите животных (ORBEA, #9/2018) и соответствовали национальным и европейским директивам по уходу за животными, а также рекомендациям ARR…

Representative Results

Успешное выполнение этого метода должно привести к четкому окрашиванию липидных капель для одновременной характеристики морфологии LD (форма и плотность липидного ядра на основе 3D-реконструкции) вместе с их пространственным распределением, количеством на общую площадь и средним разм?…

Discussion

Этот протокол BODIPY 493/503 на основе флуоресценции для оценки LD был направлен на разработку нового подхода к визуализации для оценки стеатоза печени. Учитывая сильную корреляцию между ожирением и жировой болезнью печени, диета с высоким содержанием жиров в западном стиле была использован?…

Materials

1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss