En effektiv protokol til CUT&RUN-analyse af FACS-isolerede musesatellitceller
Summary
Præsenteret her er en effektiv protokol til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) isolering af muskelsatellitceller i muselemmer tilpasset undersøgelsen af transkriptionsregulering i muskelfibre ved spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT &RUN).
Abstract
Genomdækkende analyser med små cellepopulationer er en væsentlig begrænsning for undersøgelser, især inden for stamcelleområdet. Dette arbejde beskriver en effektiv protokol til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) isolering af satellitceller fra lemmernes muskel, et væv med et højt indhold af strukturelle proteiner. Dissekerede lemmer muskler fra voksne mus blev mekanisk forstyrret ved hakning i medium suppleret med dispase og type I collagenase. Efter fordøjelsen blev homogenatet filtreret gennem cellefiltre, og celler blev suspenderet i FACS-buffer. Levedygtighed blev bestemt med fikserbar levedygtighedsplet, og immunfarvede satellitceller blev isoleret af FACS. Celler blev lyseret med Triton X-100 og frigivne kerner blev bundet til concanavalin A magnetiske perler. Kerne-/perlekomplekser blev inkuberet med antistoffer mod transkriptionsfaktoren eller histonmodifikationer af interesse. Efter vask blev kerne-/perlekomplekser inkuberet med protein A-mikrokoknukylase, og kromatinspaltning blev initieret med CaCl2. Efter DNA-ekstraktion blev biblioteker genereret og sekventeret, og profilerne for genom-wide transkriptionsfaktorbinding og kovalente histonmodifikationer blev opnået ved bioinformatisk analyse. Toppene opnået for de forskellige histonmærker viste, at bindingsbegivenhederne var specifikke for satellitceller. Desuden afslørede kendt motivanalyse, at transkriptionsfaktoren var bundet til kromatin via dets beslægtede responselement. Denne protokol er derfor tilpasset til at studere genregulering i voksne mus lemmer muskel satellitceller.
Introduction
Skeletstribede muskler udgør i gennemsnit 40% af vægten af den samlede menneskelige krop1. Muskelfibre udviser en bemærkelsesværdig evne til regenerering ved skade, hvilket beskrives ved fusion af nydannede myocytter og generering af nye myofibre, der erstatter de beskadigede2. I 1961 rapporterede Alexander Mauro en population af mononukleære celler, som han betegnede som satellitceller3. Disse stamceller udtrykker transkriptionsfaktoren parret boks 7 (PAX7) og er placeret mellem basal lamina og sarcolemma af muskelfibre4. De blev rapporteret at udtrykke klyngen af differentiering 34 (CD34; en hæmatopoietisk stamcellemarkør, endotelstamfader og mesenkymal stamcellemarkør), integrin alfa 7 (ITGA7; en glat, hjerte- og skeletmuskelmarkør) samt C-X-C kemokinreceptor type 4 (CXCR4; en lymfocyt-, hæmatopoietisk og satellitcellemarkør)5. Under basale forhold befinder satellitceller sig i et bestemt mikromiljø, der holder dem i hvilende tilstand6. Ved muskelskader bliver de aktiveret, formerer sig og gennemgår myogenese7. Men da de kun bidrager til en mindre brøkdel af det samlede antal muskelceller, er deres genom-dækkende analyser særligt udfordrende, især under fysiologiske indstillinger (<1% af de samlede celler).
Forskellige metoder til kromatinisolering fra satellitceller er blevet beskrevet, som involverer kromatinimmunudfældning efterfulgt af massiv parallel sekventering (ChIP-seq) eller spaltning under mål og tagmentation (CUT &Tag) eksperimenter. Ikke desto mindre frembyder disse to teknikker nogle væsentlige begrænsninger, der forbliver ubestridte. Faktisk kræver ChIP-seq en stor mængde udgangsmateriale til at generere nok kromatin, hvoraf en stor del går tabt under sonikeringstrinnet. CUT&Tag er mere passende til lavt celleantal, men genererer flere spaltningssteder uden for målet end ChIP-seq på grund af Tn5-transposaseaktiviteten. Da dette enzym desuden har en høj affinitet for åbne kromatinregioner, kan CUT&Tag-tilgangen fortrinsvis anvendes til analyse af histonmodifikationer eller transkriptionsfaktorer forbundet med aktivt transkriberede regioner af genomet i stedet for tavs heterochromatin 8,9.
Præsenteret her er en detaljeret protokol, der tillader isolering af muselemmer muskel satellitceller ved FACS til spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT &RUN) 10,11 analyse. De forskellige trin involverer mekanisk forstyrrelse af væv, cellesortering og kerneisolering. Metodens effektivitet, hvad angår fremstilling af en levedygtig cellesuspension, blev demonstreret ved at udføre CUT&RUN-analyse for kovalente histonmodifikationer og transkriptionsfaktorer. Kvaliteten af isolerede celler gør den beskrevne metode særlig attraktiv til fremstilling af kromatin, der trofast fanger den oprindelige genomiske belægningstilstand og sandsynligvis er egnet til at fange kromosomkonformationen i kombination med high-throughput sekventering på specifikke loci (4C-seq) eller på genom-wide niveauer (Hi-C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse rapporterer en standardiseret, pålidelig og let at udføre metode til isolering og dyrkning af musesatellitceller samt vurdering af transkriptionsregulering ved hjælp af CUT &RUN-metoden.
Denne protokol involverer flere kritiske trin. Den første er muskelforstyrrelser og fiberfordøjelse for at sikre et stort antal indsamlede celler. På trods af den øgede enzymkoncentration blev der opnået flere levende celler end ved anvendelse af protokol 1. Satellitceller udtrykker…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Anastasia Bannwarth for at yde fremragende teknisk bistand. Vi takker IGBMC-dyrehusfaciliteten, cellekulturen, Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrig), billeddannelsen, elektronmikroskopien, flowcytometrien og GenomEast-platformen, medlem af konsortiet ‘France Génomique’ (ANR-10-INBS-0009).
Dette arbejde fra det tværfaglige tematiske institut IMCBio, som en del af ITI 2021-2028-programmet ved universitetet i Strasbourg, CNRS og Inserm, blev støttet af IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) og af SFRI-STRAT’US-projektet (ANR 20-SFRI-0012) og EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) inden for rammerne af det franske investeringsprogram for fremtiden. Yderligere finansiering blev leveret af INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategisk program 24376 (til D.D.), INSERM young researcher grant (til D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, og en fransk statsfond forvaltet af ANR under rammeprogrammet Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. blev støttet af programmet CDFA-07-22 fra Université franco-allemande og Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation og K.G. af Association pour la Recherche à l’IGBMC (ARI).
Materials
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
- Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
- Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
- Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
- Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
- Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
- Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
- Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
- Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
- Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
- Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
- Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
- Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
- Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
- Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
- Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
