Summary

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

Published: July 07, 2023
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Summary

ここでは、マウス四肢筋サテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)単離のための効率的なプロトコルを、標的下での切断とヌクレアーゼを用いた放出による筋線維の転写制御の研究に適合させます(CUT&RUN)。

Abstract

小細胞集団を用いたゲノムワイド解析は、特に幹細胞分野における研究にとって大きな制約となります。この研究は、構造タンパク質を多く含む組織である四肢筋からのサテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)分離のための効率的なプロトコルについて説明しています。成体マウスの四肢の筋肉を解剖し、ディスパーゼおよびI型コラゲナーゼを添加した培地でミンチすることにより機械的に破壊した。消化後、ホモジネートをセルストレーナーでろ過し、細胞をFACSバッファーに懸濁しました。生存率は固定可能な生存率染色で決定し、免疫染色したサテライト細胞をFACSで単離しました。細胞をTriton X-100で溶解し、放出した核をコンカナバリンA磁気ビーズに結合させました。核/ビーズ複合体を、目的の転写因子またはヒストン修飾に対する抗体とインキュベートしました。洗浄後、核/ビーズ複合体をプロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼとインキュベートし、CaCl2でクロマチン切断を開始しました。DNA抽出後、ライブラリーを作製・配列決定し、ゲノムワイドな転写因子結合と共有結合ヒストン修飾のプロファイルをバイオインフォマティクス解析により取得しました。さまざまなヒストンマークについて得られたピークは、結合イベントがサテライト細胞に特異的であることを示しています。さらに、既知のモチーフ解析により、転写因子が同族の応答要素 を介して クロマチンに結合していることが明らかになりました。従ってこのプロトコルは大人のマウスの四肢筋肉衛星細胞の遺伝子の規則を調査するために合わせられる。

Introduction

骨格横紋筋は、平均して人体全体の重量の40%を占めています1。筋線維は、新たに形成された筋細胞の融合と、損傷した筋線維を置き換える新しい筋線維の生成によって説明される、損傷時に驚くべき再生能力を示す2。1961年、アレクサンダー・マウロは単核細胞の集団を報告し、これをサテライト細胞3と名付けた。これらの幹細胞は、転写因子ペアボックス7(PAX7)を発現し、筋線維4の基底層と筋膜の間に位置する。分化クラスター34(CD34;造血、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞マーカー)、インテグリンα7(ITGA7;平滑心筋マーカー、骨格筋マーカー)、C-X-Cケモカイン受容体4型(CXCR4;リンパ球、造血、サテライト細胞マーカー)5を発現していることが報告されています。基底状態では、サテライト細胞は静止状態を維持する特定の微小環境に存在します6。筋肉が損傷すると、それらは活性化され、増殖し、筋形成を受けます7。しかし、筋肉細胞の総数のごく一部にしか寄与していないため、ゲノムワイドな解析は、特に生理学的設定(全細胞の<1%)では特に困難です。

サテライト細胞からクロマチンを単離するには、クロマチン免疫沈降とそれに続くマッシブパラレルシーケンシング(ChIP-seq)や、ターゲットおよびタグメンテーション下での切断(CUT&Tag)実験など、さまざまな方法が報告されています。それにもかかわらず、これら 2 つの手法には、未解決のままであるいくつかの重大な制限があります。実際、ChIP-seqは、十分なクロマチンを生成するために大量の出発物質を必要とし、その大部分は超音波処理ステップ中に失われます。CUT&Tagは細胞数が少ない場合に適していますが、Tn5トランスポザーゼ活性により、ChIP-seqよりも多くのオフターゲット切断部位を生成します。さらに、この酵素はオープンクロマチン領域に対する親和性が高いため、ゲノムの活発に転写領域に関連するヒストン修飾や転写因子の解析には、サイレンシングされたヘテロクロマチンではなく、CUT&Tagアプローチが優先的に用いられる可能性があります8,9

ここでは、FACSによるマウス四肢筋サテライト細胞の単離を可能にし、ヌクレアーゼ(CUT&RUN)10,11分析を用いて、ターゲット下での切断と放出を可能にする詳細なプロトコルを示します。さまざまなステップには、組織の機械的破壊、細胞の選別、および核の分離が含まれます。生細胞懸濁液の調製に関するこの分析法の効率は、共有結合ヒストン修飾および転写因子のCUT&RUN解析を実施することで実証されました。単離された細胞の品質により、記載された方法は、天然のゲノム占有状態を忠実に捕捉するクロマチンを調製するのに特に魅力的であり、特定の遺伝子座(4C-seq)またはゲノムワイドレベル(Hi-C)でのハイスループットシーケンシングと組み合わせて染色体コンフォメーションを捕捉するのに適している可能性があります。

Protocol

マウスは、国家動物管理ガイドライン(欧州委員会指令86/609 / CEE;研究のための実験動物の使用に関するフランス政令第87-848号。意図された操作は、APAFIS 番号 #22281 に基づく 2010/63/EU 指令に従って倫理的評価と承認を受けるために、倫理委員会 (Com’Eth、ストラスブール、フランス) およびフランス研究省 (MESR) に提出されました。 1. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)に?…

Representative Results

マウス骨格筋からのサテライト細胞は、Gunther et al.(以下、プロトコル1)12 およびLiuら23 (以下、プロトコル2)のプロトコルを組み合わせて単離した。プロトコル1で提案された濃度のコラゲナーゼとディスパーゼを使用すると、消化後に未消化の筋線維が観察されたため、ステップ1.2.1および1.2.3に記載されているように、酵素の量を増やして筋線維の解離を改…

Discussion

本研究は、マウスサテライト細胞の単離と培養、ならびにCUT&RUN法による転写制御の評価のための標準化された信頼性と実施が容易な方法を報告する。

このプロトコルには、いくつかの重要なステップが含まれます。1つ目は、筋肉の破壊と繊維の消化で、多くの細胞を確実に集めることです。酵素濃度が上昇したにもかかわらず、プロトコル1を使用した場合よりも多く?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

優れた技術支援を提供してくれたAnastasia Bannwarthに感謝します。IGBMCアニマルハウス施設、細胞培養、マウス臨床研究所(ICS、Illkirch、フランス)、イメージング、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、および「France Génomique」コンソーシアムのメンバーであるGenomEastプラットフォーム(ANR-10-INBS-0009)に感謝します。

ストラスブール大学、CNRS、InsermのITI 2021-2028プログラムの一環として、学際的テーマ別研究所IMCBioのこの取り組みは、フランスの未来への投資プログラムの枠組みの下で、IdEx Unistra(ANR-10-IDEX-0002)とSFRI-STRAT’USプロジェクト(ANR 20-SFRI-0012)およびEUR IMCBio(ANR-17-EURE-0023)の支援を受けました。追加資金は、INSERM、CNRS、Unistra、IGBMC、Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR)、AFM-Téléthon strategic program 24376 (to D.D.)、INSERM young researcher grant (to D.D.)、ANR-10-LABX-0030-INRT、およびフレームプログラムInvestissements d’Avenir(ANR-10-IDEX-0002-02)の下でANRが管理するフランスの国家基金によって提供されました。J.R.は、Université franco-allemandeおよびMinistère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’InnovationのプログラムCDFA-07-22、およびAssociation pour la Recherche à l’IGBMC(ARI)のK.G.の支援を受けました。

Materials

1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

References

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Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

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