FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜
Summary
여기에 제시된 것은 뉴클레아제를 사용한 표적 절단 및 방출에 의한 근육 섬유의 전사 조절 연구에 적합한 마우스 사지 근육 위성 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분리를 위한 효율적인 프로토콜입니다(CUT&RUN).
Abstract
작은 세포 집단을 사용한 게놈 전체 분석은 특히 줄기 세포 분야에서 연구의 주요 제약 조건입니다. 이 연구는 구조 단백질 함량이 높은 조직인 사지 근육에서 위성 세포를 분리하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 성인 마우스에서 절개된 사지 근육은 dispase 및 type I 콜라겐분해효소가 보충된 배지에서 다져서 기계적으로 파괴되었습니다. 분해 시, 균질액을 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 세포를 FACS 완충액에 현탁시켰다. 생존율은 고정 가능한 생존도 염색으로 측정하고, 면역염색된 위성 세포는 FACS로 분리했습니다. 세포를 Triton X-100으로 용해시키고 방출된 핵을 콘카나발린 A 자성 비드에 결합시켰습니다. 핵/비드 복합체는 전사 인자 또는 관심 히스톤 변형에 대한 항체와 함께 배양되었습니다. 세척 후, 핵/비드 복합체를 단백질 A-마이크로코커스 뉴클레아제로 배양하고, 염색질 절단은 CaCl2로 개시하였다. DNA 추출 후, 라이브러리를 생성하고 서열을 분석하고, 생물정보학 분석을 통해 게놈 전체 전사 인자 결합 및 공유 히스톤 변형에 대한 프로파일을 얻었다. 다양한 히스톤 마크에 대해 얻은 피크는 결합 이벤트가 위성 세포에 특이적임을 보여주었습니다. 또한, 알려진 모티프 분석은 전사 인자가 동족 반응 요소를 통해 염색질에 결합되어 있음을 밝혔습니다. 따라서 이 프로토콜은 성체 마우스 사지 근육 위성 세포의 유전자 조절을 연구하는 데 적합합니다.
Introduction
골격근은 평균 인체 전체 체중의 40%를 차지한다1. 근섬유는 손상 시 현저한 재생 능력을 나타내는데, 이는 새로 형성된 근세포의 융합과 손상된 근섬유를 대체하는 새로운 근섬유의 생성으로 설명된다2. 1961년, 알렉산더 마우로(Alexander Mauro)는 위성 세포(satellite cell)라고 명명한 단핵 세포(mononuclear cell)의 집단을 보고했다.3 이들 줄기세포는 전사인자 쌍을 이루는 상자7(PAX7)을 발현하며, 근섬유의 기저층(basal lamina)과 근섬유(sarcolemma) 사이에위치한다4. 이들은 분화 클러스터 34(CD34, 조혈, 내피 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포 마커), 인테그린 알파 7(ITGA7, 부드러운 심장 및 골격근 마커) 및 C-X-C 케모카인 수용체 유형 4(CXCR4, 림프구, 조혈 및 위성 세포 마커)5를 발현하는 것으로 보고되었습니다. 기초 조건에서, 위성 세포는 정지 상태를 유지하는 특정 미세환경에 상주한다6. 근육이 손상되면 근육이 활성화되고 증식하며 근육 형성을 겪는다7. 그러나 전체 근육 세포 수의 극히 일부에만 기여하기 때문에 게놈 전체 분석은 특히 생리학적 환경(전체 세포의 <1%)에서 특히 까다롭습니다.
위성 세포로부터 염색질 분리를 위한 다양한 방법이 설명되었는데, 이는 염색질 면역침전 후 대규모 병렬 염기서열분석(ChIP-seq) 또는 표적 및 태깅 하에서의 절단(CUT&Tag) 실험을 포함합니다. 그럼에도 불구하고 이 두 가지 기술에는 도전하지 않은 몇 가지 중요한 한계가 있습니다. 실제로, ChIP-seq는 충분한 염색질을 생성하기 위해 많은 양의 출발 물질을 필요로하며, 그 중 상당 부분은 초음파 처리 단계에서 손실됩니다. CUT&Tag는 낮은 세포 수에 더 적합하지만 Tn5 전이효소 활성으로 인해 ChIP-seq보다 더 많은 off-target 절단 부위를 생성합니다. 또한, 이 효소는 개방 염색질 영역에 대한 친화력이 높기 때문에 침묵된 헤테로크로마틴 8,9 대신 게놈의 능동적으로 전사된 영역과 관련된 히스톤 변형 또는 전사 인자를 분석하기 위해 CUT&Tag 접근법을 우선적으로 사용할 수 있습니다.
여기에 제시된 것은 뉴클레아제(CUT&RUN)10,11 분석을 사용하여 표적 아래 절단 및 방출을 위해 FACS에 의해 마우스 사지 근육 위성 세포를 분리할 수 있는 자세한 프로토콜입니다. 다양한 단계에는 조직의 기계적 파괴, 세포 분류 및 핵 분리가 포함됩니다. 생존 가능한 세포 현탁액의 제조와 관련하여이 방법의 효율성은 공유 히스톤 변형 및 전사 인자에 대한 CUT &RUN 분석을 수행하여 입증되었습니다. 분리된 세포의 품질은 기술된 방법을 본래의 게놈 점유 상태를 충실하게 포착하는 염색질 제조에 특히 매력적으로 만들고, 특이적 유전자좌(4C-seq) 또는 게놈 전체 수준(Hi-C)에서 고처리량 시퀀싱과 함께 염색체 형태를 포착하는 데 적합할 가능성이 높다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 마우스 위성 세포의 분리 및 배양을 위한 표준화되고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법과 CUT&RUN 방법에 의한 전사 조절 평가를 보고합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫 번째는 근육 파괴와 섬유질 소화를 통해 많은 수의 세포를 수집할 수 있도록 하는 것입니다. 효소 농도가 증가했음에도 불구하고, 프로토콜 1을 사용한 것보다 더 많…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
훌륭한 기술 지원을 제공해 주신 Anastasia Bannwarth에게 감사드립니다. IGBMC 동물 사육 시설, 세포 배양, Mouse Clinical Institute(ICS, Illkirch, France), 이미징, 전자 현미경, 유세포 분석 및 ‘France Génomique’ 컨소시엄(ANR-10-INBS-0009)의 회원인 GenomEast 플랫폼에 감사드립니다.
스트라스부르 대학교, CNRS 및 Inserm의 ITI 2021-2028 프로그램의 일환으로 학제 간 주제 연구소 IMCBio의 이 작업은 IdEx Unistra(ANR-10-IDEX-0002)와 SFRI-STRAT’US 프로젝트(ANR 20-SFRI-0012) 및 EUR IMCBio(ANR-17-EURE-0023)의 지원을 받았습니다. 추가 자금은 INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon 전략 프로그램 24376 (D.D.), INSERM 젊은 연구자 보조금 (D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT 및 프레임 프로그램 Investissements d’ Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02)에 따라 ANR이 관리하는 프랑스 국가 기금에 의해 전달되었습니다. J.R.은 Université franco-allemande 및 Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation의 프로그램 CDFA-07-22와 Association pour la Recherche à l’IGBMC (ARI)의 K.G.의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
References
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