Här presenteras ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av muskelsatellitceller i musextremiteter anpassade för studier av transkriptionsreglering i muskelfibrer genom klyvning under mål och frisättning med hjälp av nukleas (CUT&RUN).
Genomomfattande analyser med små cellpopulationer är ett stort hinder för studier, särskilt inom stamcellsområdet. Detta arbete beskriver ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av satellitceller från extremitetsmuskeln, en vävnad med ett högt innehåll av strukturella proteiner. Dissekerade extremitetsmuskler från vuxna möss stördes mekaniskt genom malning i medium kompletterat med dispase och kollagenas typ I. Vid matsmältningen filtrerades homogenatet genom cellsilar och cellerna suspenderades i FACS-buffert. Viabiliteten bestämdes med fixerbar viabilitetsfläck och immunfärgade satellitceller isolerades med FACS. Celler lyserades med Triton X-100 och frigjorda kärnor bands till konanavalin A magnetiska pärlor. Kärn-/pärlkomplex inkuberades med antikroppar mot transkriptionsfaktorn eller histonmodifieringar av intresse. Efter tvätt inkuberades kärn-/pärlkomplex med protein A-mikrokocknukleas, och kromatinklyvning initierades med CaCl2. Efter DNA-extraktion genererades och sekvenserades bibliotek, och profilerna för genomomfattande transkriptionsfaktorbindning och kovalenta histonmodifieringar erhölls genom bioinformatisk analys. De toppar som erhölls för de olika histonmarkeringarna visade att bindningshändelserna var specifika för satellitceller. Dessutom avslöjade känd motivanalys att transkriptionsfaktorn var bunden till kromatin via dess kognata responselement. Detta protokoll är därför anpassat för att studera genreglering i vuxna mösss muskelsatellitceller.
Tvärstrimmiga skelettmuskler utgör i genomsnitt 40 % av vikten av den totala människokroppen1. Muskelfibrer uppvisar en anmärkningsvärd förmåga till regenerering vid skada, vilket beskrivs av sammansmältningen av nybildade myocyter och genereringen av nya myofibrer som ersätter de skadade2. År 1961 rapporterade Alexander Mauro en population av mononukleära celler som han kallade satellitceller3. Dessa stamceller uttrycker transkriptionsfaktorn parad box 7 (PAX7) och är belägna mellan den basala laminan och sarkolemma av muskelfibrer4. De rapporterades uttrycka kluster av differentiering 34 (CD34; en hematopoetisk, endotelial stamcellsmarkör och mesenkymal stamcellsmarkör), integrin alfa 7 (ITGA7; en markör för glatt muskulatur, hjärt- och skelettmuskulatur), såväl som C-X-C-kemokinreceptorn typ 4 (CXCR4; en lymfocyt-, hematopoetisk och satellitcellmarkör)5. Under basala förhållanden befinner sig satellitceller i en viss mikromiljö som håller dem i ett vilande tillstånd6. Vid muskelskador aktiveras de, förökar sig och genomgår myogenes7. Men eftersom de bara bidrar till en mindre del av det totala antalet muskelceller är deras genomomfattande analyser särskilt utmanande, särskilt under fysiologiska miljöer (<1 % av det totala antalet celler).
Olika metoder för kromatinisolering från satellitceller har beskrivits, vilka involverar kromatinimmunprecipitering följt av massiv parallell sekvensering (ChIP-seq) eller klyvning under targets och tagmentation (CUT&Tag) experiment. Ändå har dessa två tekniker några betydande begränsningar som förblir oemotsagda. Faktum är att ChIP-seq kräver en stor mängd utgångsmaterial för att generera tillräckligt med kromatin, varav en stor del går förlorad under ultraljudsbehandlingen. CUT&Tag är mer lämpligt för lågt cellantal, men genererar fler klyvningsställen utanför målet än ChIP-seq på grund av Tn5-transposasaktiviteten. Dessutom, eftersom detta enzym har en hög affinitet för öppna kromatinregioner, kan CUT&Tag-metoden företrädesvis användas för att analysera histonmodifieringar eller transkriptionsfaktorer associerade med aktivt transkriberade regioner i genomet, istället för tystat heterokromatin 8,9.
Här presenteras ett detaljerat protokoll som gör det möjligt att isolera musmuskelsatellitceller med FACS för klyvning under mål och frisättning med hjälp av nukleas (CUT&RUN)10,11-analys. De olika stegen involverar mekanisk störning av vävnad, cellsortering och isolering av kärnor. Metodens effektivitet, när det gäller beredning av en livskraftig cellsuspension, demonstrerades genom att utföra CUT&RUN-analys för kovalenta histonmodifieringar och transkriptionsfaktorer. Kvaliteten på isolerade celler gör den beskrivna metoden särskilt attraktiv för att framställa kromatin som fångar det ursprungliga genomiska beläggningstillståndet troget, och är sannolikt lämplig för att fånga kromosomkonformationen i kombination med storskalig sekvensering på specifika loci (4C-seq) eller på genomomfattande nivåer (Hi-C).
Den aktuella studien redovisar en standardiserad, tillförlitlig och lättanvänd metod för isolering och odling av mussatellitceller, samt bedömning av transkriptionsreglering med CUT&RUN-metoden.
Detta protokoll omfattar flera kritiska steg. Den första är muskelstörningar och fibersmältning för att säkerställa ett stort antal insamlade celler. Trots den ökade enzymkoncentrationen erhölls fler levande celler än med hjälp av protokoll 1. Satellitceller uttrycker ett specifikt mön…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Anastasia Bannwarth för utmärkt teknisk assistans. Vi tackar IGBMC:s djurhusanläggning, cellodlingen, Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrike), avbildningen, elektronmikroskopin, flödescytometrin och GenomEast-plattformen, en medlem av konsortiet “France Génomique” (ANR-10-INBS-0009).
Detta arbete från det tvärvetenskapliga tematiska institutet IMCBio, som en del av ITI-programmet 2021-2028 vid Strasbourgs universitet, CNRS och Inserm, stöddes av IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) och av SFRI-STRAT’US-projektet (ANR 20-SFRI-0012) och EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) inom ramen för det franska programmet Investments for the Future. Ytterligare finansiering tillhandahölls av INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategiska program 24376 (till D.D.), INSERM young research grant (till D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, och en fransk statlig fond som förvaltas av ANR inom ramen för ramprogrammet Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. stöddes av programmet CDFA-07-22 från Université franco-allemande och Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation, och K.G. av Association pour la Recherche à l’IGBMC (ARI).
1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
anti-AR | abcam | ab108341 | |
anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
anti-DMD | abcam | ab15277 | |
anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |