Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie. De experimentele procedure omvat monstervoorbereiding, beeldacquisitie en visualisatie.
Abstract
Als gewerveld modeldier worden larvale zebravissen veel gebruikt in de neurowetenschappen en bieden ze een unieke kans om de activiteit van de hele hersenen op cellulaire resolutie te volgen. Hier bieden we een geoptimaliseerd protocol voor het uitvoeren van beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie, inclusief monstervoorbereiding en immobilisatie, monsterinbedding, beeldacquisitie en visualisatie na beeldvorming. Het huidige protocol maakt in vivo beeldvorming van de structuur en neuronale activiteit van een larvale zebravisbrein mogelijk met een cellulaire resolutie gedurende meer dan 1 uur met behulp van confocale microscopie en op maat ontworpen fluorescentiemicroscopie. De kritieke stappen in het protocol worden ook besproken, waaronder monstermontage en -positionering, het voorkomen van bellenvorming en stof in de agarose-gel en het vermijden van beweging in beelden veroorzaakt door onvolledige stolling van de agarose-gel en verlamming van de vis. Het protocol is gevalideerd en bevestigd in meerdere instellingen. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor het in beeld brengen van andere organen van een larvale zebravis.
Introduction
Zebravis (Danio rerio) is op grote schaal aangenomen als een model gewerveld dier in de neurowetenschappen, vanwege zijn optische transparantie in het larvale stadium, zijn snelle ontwikkeling, zijn lage onderhoudskosten en de beschikbaarheid van diverse genetische hulpmiddelen 1,2,3,4. In het bijzonder biedt de optische transparantie van larven in combinatie met genetisch gecodeerde fluorescerende reporters van biologische gebeurtenissen 5,6,7,8,9 een unieke kans om zowel neuronale activiteit als structuur op het niveau van de hele hersenen in beeld te brengen 10,11,12,13,14 . Zelfs met een microscoop die cellulaire resolutie ondersteunt, behouden de verkregen beelden echter niet noodzakelijkerwijs de informatie op het niveau van één cel; De optische beeldkwaliteit kan worden aangetast als gevolg van de aberratie die wordt geïntroduceerd door de agarose-gel die wordt gebruikt voor het monteren van monsters, de vis kan onder een hoek worden gemonteerd, waardoor de interessegebieden niet volledig binnen het gezichtsveld van de microscoop zijn opgenomen en de vis kan tijdens de opname bewegen, waardoor bewegingsartefacten in de beelden ontstaan of een nauwkeurige signaalextractie uit de beelden wordt belemmerd.
Er is dus een effectief en reproduceerbaar protocol nodig om beeldgegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen met minimale ruis en beweging. Helaas beschrijven openbaar beschikbare protocollen voor het in vivo in vivo in beeld brengen van een heel brein van larvale zebravissen 15,16,17,18,19 slechts kort de procedure, waarbij substantiële delen van de details, zoals agarose stolling, nauwkeurige montagetechnieken en monsterpositionering met behulp van een tang, aan elke experimentalist worden overgelaten. Bovendien kunnen inconsistenties in agaroseconcentratie en immobilisatiemethoden 10,11,14,15,16,17,18,19 leiden tot uitdagingen die voortvloeien uit visbewegingen tijdens het beeldvormingsproces.
Hier wordt een gedetailleerd protocol voor beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie verstrekt. Figuur 1 geeft een grafisch overzicht van het protocol: monstervoorbereiding en immobilisatie, sample embedding, beeldacquisitie en visualisatie na beeldvorming. De structurele en functionele beeldvorming van het larvale zebravisbrein in vivo wordt gedemonstreerd met behulp van een commerciële confocale microscoop en een op maat ontworpen fluorescentiemicroscoop. Dit protocol kan door beoefenaars worden aangepast voor beeldvorming van de hersenen met bepaalde sensorische stimuli of gedragscontexten, afhankelijk van de experimentele behoeften en het ontwerp.
Protocol
Alle zebravisexperimenten zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van KAIST (KA2021-125). Een totaal van 12 volwassen zebravissen met pan-neuronale expressie van de calciumindicator GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)] op een casper [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)] achtergrond werden gebruikt voor de fokkerij. Deze groep bestond uit acht vrouwtjes en vier mannetjes, met leeftijden variërend van 3 tot 12 maanden. Beeldvormingsexperimenten werden uitgevoerd op larvale zebravissen 3-4 dagen na de bevruchting (d.p.f.), een stadium waarin hun geslacht niet kan worden bepaald.
1. Monstervoorbereiding van zebravissen
- Verzamel embryo's na het kweken van volwassen vissen van een gewenste transgene lijn, zoals Tg (huc: GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)20,21,22, in een petrischaaltje gevuld met eiwater (zie materiaaltabel). Plaats de embryo's in een couveuse bij 28 °C en breng ze op tot 3-4 d.p.f. larven23,24,25.
- Als de achtergrond van de zebravis geen albino is, om een vorming van pigmentatie te remmen, breng de embryo's 24 uur na de bevruchting (h.p.f.) over in de petrischaal gevuld met eiwater met 200 μM 1-fenyl 2-thioureum (PTU; zie materiaaltabel)25,26. Breng de vis elke 24 uur over in een nieuwe schaal met vers eiwater met 200 μM PTU.
OPMERKING: De zebravissen worden onder standaardomstandigheden bij 28 °C en een licht:donkercyclus van 14:10 uur gehouden. Van de PTU-behandeling is bekend dat deze het gedrag en de schildklierfunctie van larvale zebravissenbeïnvloedt 27,28. Daarom is het belangrijk om de PTU met voorzichtigheid te gebruiken en zorgvuldig te controleren op mogelijke verstorende factoren in eventuele experimenten.
- Als de achtergrond van de zebravis geen albino is, om een vorming van pigmentatie te remmen, breng de embryo's 24 uur na de bevruchting (h.p.f.) over in de petrischaal gevuld met eiwater met 200 μM 1-fenyl 2-thioureum (PTU; zie materiaaltabel)25,26. Breng de vis elke 24 uur over in een nieuwe schaal met vers eiwater met 200 μM PTU.
- Om het monster te vinden dat fluorescerende eiwitten van belang tot expressie brengt (bijv. Pan-neuronale GCaMP7a), screent u het monster onder een epifluorescentiemicroscoop en selecteert u een monster met een heldere expressie.
- Bereid het geselecteerde 3-4 d.p.f. zebravismonster in de petrischaal gevuld met eiwater (figuur 2A).
OPMERKING: Om spontane neuronale activiteit te registreren, wordt aanbevolen om monsters te gebruiken die tussen 80-100 h.p.f. oud zijn, omdat het niveau van spontane activiteit laag is vóór 80 h.p.f. en pigmentatieontwikkeling, zelfs met een casperachtergrond, de beeldkwaliteit na 100 h.p.f. kan verslechteren. - Bereid een pancuroniumbromideoplossing van 0,25 mg/ml 14,19,29,30,31 door 1 ml van een stamoplossing van 2,5 mg/ml (zie materiaaltabel) toe te voegen aan 10 ml eiwater. Aliquot de pancuroniumbromide-oplossing in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
- Breng het vooraf gescreende monster over in de petrischaal met behulp van een transferpipet.
OPMERKING: Probeer een minimaal volume eiwater met het monster mee te nemen. - Breng 0,1 ml van de pancuroniumbromide-oplossing over in de petrischaal voor verlamming.
OPMERKING: Pancuroniumbromide heeft een potentieel dempend effect op de neurale activiteit bij larvale zebravissen32. Het is van essentieel belang om de concentratie en de duur van de blootstelling aan pancuroniumbromide zorgvuldig te overwegen.
2. 2% (WT / vol) agarose gel preparaat
- Schakel een warmteblok in en stel de doeltemperatuur in op 37 °C. Wacht tot het apparaat is opgewarmd en evenwichtig is bij de ingestelde temperatuur.
- Los 0,2 g agarosepoeder met een laag smeltpunt (zie materiaaltabel) op in 10 ml eiwater.
- Verwarm de agarose-oplossing in een magnetron en meng deze door schudden en vortexen totdat de agarose volledig is opgelost.
- Aliquoteer de agarosegel in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en bewaar de microcentrifugebuizen op het warmteblok (figuur 2B).
OPMERKING: Controleer of de bubbels in de agarose-gel zijn verdwenen.
3. Monstermontage en positionering
- Controleer het monster onder een stereomicroscoop om te controleren of de beweging van de larven is gestopt en om de gezondheid van het monster visueel te evalueren door de hartslag te controleren (figuur 2C). Als de hartslag te langzaam is, gooit u het monster weg.
OPMERKING: Als de hartslag van de vis die wordt afgebeeld te langzaam is (bijvoorbeeld minder dan 60 slagen per minuut), is het mogelijk dat het niet mogelijk is om langetermijnbeelden uit te voeren. Om het welzijn van de vis te beoordelen, kan de hartslag visueel worden gecontroleerd door deze te vergelijken met andere vissen in dezelfde petrischaal. Dit zal helpen ervoor te zorgen dat de vis die wordt afgebeeld gezond en stabiel genoeg is voor de beeldvormingsprocedure. - Plaats met behulp van de transferpipet een enkele larvale zebravis in de agarosegel in de microcentrifugebuis van 1,5 ml (figuur 2D).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de pipet weggooit na het overbrengen van het monster. - Giet de agarosegel in de petrischaal om een laag van 1-2 mm te maken. Breng het monster in de microcentrifugebuizen over naar de petrischaal met behulp van de transferpipet, zodat de larve in het midden van de schaal wordt geplaatst.
OPMERKING: Als er stof en bubbels in de agarosegel zitten, verwijder deze dan met de transferpipet. - Gebruik een tang om het monster in de gewenste richting te plaatsen, zodat de kop en de staart plat zijn (figuur 2E).
- Draai het monster met een tang zodat beide ogen waterpas staan (figuur 2F).
OPMERKING: Uitlijnprocedures (positie en rotatie) moeten worden voltooid voordat de agarose-gel begint te stollen. - Wacht na de uitlijning tot de agarosegel is gestold (figuur 2G,H).
OPMERKING: De wachttijd voor de agarosegel om te stollen kan variëren van 5-10 minuten, afhankelijk van het volume en de grootte van de gel. - Na het stollen van de agarosegel vult u de petrischaal met eiwater en plaatst u de petrischaal met het ingebedde monster op het microscoopstadium (figuur 2I).
4. Beeldacquisitie
- Schakel het microscoopsysteem in (bijvoorbeeld lasers, confocale controllers, microscoop en computer; zie Materiaaltabel) en controleer of het hele systeem werkt.
- Selecteer een objectief met een lage vergroting en zoek het monster in het midden van het gezichtsveld.
- Selecteer een water-immersie of water-dipping objectief lens met de juiste vergroting (bijv. 16x 0.8 numerieke diafragma (NA) water-dipping lens; zie tabel van materialen). Maak fijne aanpassingen aan het gezichtsveld.
- Stel de beeldparameters in (bijv. beeldgrootte, laservermogen, belichtingstijd, aantal frames) met behulp van beeldacquisitiesoftware.
OPMERKING: Stel de beeldparameters in om de best mogelijke resultaten voor specifieke behoeften te bereiken (zie de instelling voor beeldacquisitie in de sectie representatieve resultaten). Als het beeld verzadigd is, vermindert u het laservermogen. - Zoek de hersenen van het monster door het podium te verplaatsen en bepaal de dikte ervan met behulp van de live view-modus in de software door de brandpuntsvlakken handmatig op en neer te veranderen. Stel de onder- en bovengrenzen van het volume in.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de hele hersenen zich in het gezichtsveld bevinden langs zowel de laterale als de axiale richting. - Stel een z-stapgrootte in, rekening houdend met de axiale resolutie van de microscoop.
OPMERKING: De optimale z-stapgrootte voor het in beeld brengen van het larvale zebravisbrein hangt af van de beeldvormingsmodaliteit en de resolutie van de microscoop. Als voorbeeld werd een z-stapgrootte van 5 μm gebruikt, rekening houdend met de dikte van de lichte plaat en de gemiddelde diameter van de cellichamen10. - Ga verder met de beeldacquisitie voor het ingestelde gezichtsveld.
- Voor volumetrische structurele beeldvorming verkrijgt u een 3D-beeld (x, y, z) van de hele hersenen door de brandpuntsvlakken te wijzigen en 2D-afbeeldingen van elk z-vlak achtereenvolgens te verkrijgen.
- Voor functionele beeldvorming van een enkel z-vlak, verkrijg tijdreeksbeelden (x, y, t) van de neuronale activiteit van de hersenen op een bepaalde diepte.
- Voor volumetrische functionele beeldvorming verkrijgt u een 4D-beeld (x,y,z,t) van de neuronale activiteit in de hele hersenen door achtereenvolgens 3D-beelden te verkrijgen.
OPMERKING: Stel het aantal frames in, rekening houdend met de beschikbare geheugengrootte van de computer. Een acquisitietijd van minder dan 1 uur wordt aanbevolen vanwege de duur van het effect van pancuroniumbromide.
- Nadat u afbeeldingen hebt verkregen, slaat u de resultaten op en registreert u de beeldparameters (bijv. Pixelgrootte, z-stapgrootte, framesnelheid, laservermogen) voor beeldanalyse.
- Exporteer de afbeeldingen in een geschikte indeling voor gegevensweergave en beeldanalyse.
OPMERKING: Het exporteren van afbeeldingen in TIF-indeling (tagged image file) wordt aanbevolen. TIF ondersteunt lossless beeldcompressie en is compatibel met de meeste beeldverwerkingssoftware en programmeertalen. Bovendien ondersteunt het TIF-formaat de opname van metagegevens, zoals acquisitieparameters, afbeeldingsresolutie en andere relevante informatie die kan helpen bij de interpretatie en reproduceerbaarheid van gegevens.
5. Instellen voor visualisaties met behulp van napari
OPMERKING: napari is een open-source multidimensionale afbeeldingsviewer in een Python-omgeving met op grafische verwerkingseenheid (GPU) gebaseerde rendering33. De napari-animatie plugin biedt een programmatische creatie van films. Het gebruik van Fiji, een open-source beeldverwerkingsprogramma, wordt aanbevolen voor algemene beeldverwerking, zoals filtering en geometrische transformatie (zie Materiaaltabel). De broncode die wordt gebruikt voor de visualisatie met behulp van napari is beschikbaar op GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).
- Installeer napari en napari-animatie met pip of conda. Maak na de installatie een nieuw jupyter-notitieblokbestand.
OPMERKING: Uitvoeren met jupyter notebook, een interactieve tool voor Python, wordt aanbevolen boven het Python-script. - Importeer napari en napari-animatie.
6. Structuren visualiseren met behulp van napari
- Om afbeeldingen te visualiseren en films te maken van het gerenderde zebravisbrein, laadt u de 3D-afbeelding (x,y,z) en opent u het napari-venster. Sluit de napari-animatie plugin aan (Figuur 3A).
- Stel parameters in zoals voxelgrootte, colormap en contrastlimieten in de laagbesturingselementen.
- Pas de kijkersinstellingen (bijvoorbeeld perspectief, hoeken) in het canvas aan.
- Als u de gerenderde afbeelding wilt vastleggen, drukt u op de opnameknop in de animatiewizard.
- Als u films van het gerenderde volume wilt genereren, wijzigt u de instellingen van de viewer en voegt u sleutelframes toe (afbeelding 3B).
- Nadat u sleutelframes hebt toegevoegd, stelt u het aantal frames (stappen) tussen sleutelframes in de animatiewizard in. Sla de gerenderde animatie op.
7. Beeldverwerking en visualisatie van neuronale activiteit met behulp van napari
OPMERKING: Om de tijdreeksafbeeldingen van neuronale activiteit te visualiseren als overlay-afbeeldingen van een statische achtergrond en activiteit, moet een ontledingsalgoritme worden toegepast op de onbewerkte afbeeldingen. Gebruik een MATLAB-implementatie van een decompositiealgoritme genaamd BEAR24. De MATLAB-versie van BEAR is beschikbaar op GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).
- Als u de statische achtergrond en neuronale activiteit wilt ontleden, past u BEAR toe op de onbewerkte tijdreeksafbeeldingen (x,y,t of x,y,z,t). Sla na de ontbinding de afbeeldingen van de achtergrond en neuronale activiteit op als TIF-bestanden (figuur 3C).
- Laad de achtergrond- en neuronale activiteitsafbeeldingen en open het napari-venster. Sluit de napari-animatie plug-in aan.
- Gebruik een grijze kleurenkaart voor achtergrondafbeeldingen en een hot colormap voor neuronale activiteitsafbeeldingen (afbeelding 3C).
- Stel parameters in zoals dekkings- en contrastlimieten in de laagbesturingselementen.
- Als u films met neuronale activiteit wilt genereren, wijzigt u de instellingen van de viewer en voegt u sleutelframes toe om de animatie weer te geven.
- Nadat u sleutelframes hebt toegevoegd, stelt u het aantal frames (stappen) tussen sleutelframes in de animatiewizard in. Sla de gerenderde animatie op.
Representative Results
De structuur en neuronale activiteit van de larvale zebravishersenen die calciumindicator pan-neuronale GCaMP7a (Tg (huc: GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 met een casper (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 achtergrond werd afgebeeld op 3-4 d.p.f. door het beschreven protocol te volgen.
Voor volumetrische structurele beeldvorming werd het monster in beeld gebracht met behulp van een commercieel puntscannend confocaal microscopiesysteem uitgerust met een 16x 0,8 NA waterdippende objectieflens. Een 488 nm excitatielaser werd gebruikt voor zowel structurele als functionele beeldvorming. De framesnelheid, beeldresolutie, pixelgrootte en axiale stapgrootte waren respectievelijk 0,25 Hz, 2048 x 2048, 0,34 μm en 1,225 μm. De beeldacquisitie duurde ongeveer 1 uur en 20 minuten. Het volumetrische gezichtsveld van het verkregen beeld besloeg de hersengebieden van de voorhersenen, middenhersenen en achterhersenen (figuur 4A). Neuronale cellichamen van de medulla oblongata, cerebellaire plaat, optisch tectum, habenula en dorsale telencephalon in de hele hersenen van 4 d.p.f. larvale zebravissen waren duidelijk zichtbaar in de confocale microscopiebeelden (figuur 4B). De 3D-weergave van de confocale microscopiebeelden werd uitgevoerd met behulp van napari27 door het bovengenoemde protocol te volgen (figuur 4C en video 1).
Voor functionele beeldvorming in 2D werd het monster in beeld gebracht met behulp van hetzelfde confocale microscopiesysteem, uitgerust met een 16x 0,8 NA waterdiplens. De framesnelheid, beeldresolutie en pixelgrootte waren respectievelijk 2 Hz, 512 x 256 en 1,5 μm. De neuronale cellichamen waren duidelijk zichtbaar op zowel de achtergrond als de boven elkaar geplaatste neuronale activiteit (figuur 5A,B).
Voor 3D-functionele beeldvorming werd een op maat ontworpen 3D-microscopiesysteem18 gebruikt, dat in staat was om in vivo de neuronale activiteit van een heel larvaal zebravisbrein in beeld te brengen met een gezichtsveld van 1.040 μm × 400 μm × 235 μm en laterale en axiale resoluties van respectievelijk 1,7 μm en 5,4 μm. De beeldsnelheid was maximaal 4,2 volumes per seconde. Net als bij het renderen van de structurele beeldvormingsgegevens, werd napari gebruikt voor 3D-weergave van de calciumbeeldvormingsgegevens van de hele hersenen (figuur 5C en video 2).
Figuur 1: Overzicht van de experimentele procedure. Monstervoorbereiding en verlamming van zebravissen (stap 1). Het 2% (wt/vol) agarose gel preparaat (stap 2). Monstermontage en -positionering (stap 3). Beeldacquisitie (stap 4). Beeldverwerking en visualisatie van structuur en neuronale activiteit (stap 5-7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimentele procedure voor het voorbereiden van beeldvorming van de hele hersenen . (A) Gescreend zebravismonster dat panneuronale GCaMP7a tot expressie brengt in een petrischaal gevuld met eiwater. B) Apparatuur en materiaal die nodig zijn voor de montage en positionering van monsters. (1) Warmteblok bij 37 °C; (2) 2% (wt/vol) agarose gel; (3) 1,5 ml microcentrifugebuis; (4) eiwater; (5) 0,25 mg/ml pancuroniumbromideoplossing; (6) Petrischaaltje; (7) tang; (8) pipetteer overbrengen. (C) Stereomicroscoopbeeld van het verlamde monster. De zwarte pijl wijst naar het hart van het monster. D) Het monster in de microcentrifugebuis van 1,5 ml wordt met behulp van een pipet overgebracht. De inzet toont een vergrote weergave van het ingepakte gebied. (E) Het monster (zwarte pijl) wordt met een tang in het midden van de petrischaal geplaatst. (F) Het monster wordt uitgelijnd met een tang. (G) Een voorbeeld van een verkeerd uitgelijnd ingesloten monster. (H) Een voorbeeld van een uitgelijnd ingesloten monster. (I) Het monster wordt op een microscooppodium onder de objectieve lens geplaatst voor beeldacquisitie. Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Visualisatie van larvale zebravis hersenbeelden . (A) De 3D-weergave van een confocaal microscopiebeeld van een larvale zebravis (4 d.p.f) hersenen die panneuronale GCaMP7a tot expressie brengen. napari, een open-source multidimensionale beeldviewer in een Python-omgeving, werd gebruikt voor de rendering. Het napari-venster bestaat uit laagbesturingselementen (rood vak), een lagenlijst (geel vak), een canvas (blauw vak) en een animatiewizard (groen vak). (B) Sleutelframes met meerdere viewerinstellingen worden toegevoegd voor het renderen van een animatie. (C) Confocale microscopieafbeelding van 2-D time-lapse beeldvorming van de neuronale activiteit in de hersenen van de larvale zebravis. Het beeld wordt ontleed naar de achtergrond (links) en neuronale activiteit (midden) en vervolgens bedekt (rechts). Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Beeldvormingsstructuur van een larvale zebravishersenen. (A) Maximale intensiteitsprojectie (MIP) van een confocaal microscopiebeeld van een larvale zebravis (4 d.p.f.) hersenen die panneuronale GCaMP7a tot expressie brengen. Boven: laterale MIP. Onder: axiale MIP. Elke grens bevat de voorhersenen (rood), middenhersenen (geel) en achterhersenen (blauw). (B) Een totaal van 10 axiale plakjes op meerdere diepten van een volumetrische afbeelding van de hersenen (bij z = 25 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, 250 μm, van boven naar beneden geteld; z = 0 μm geeft het bovenoppervlak van de hersenen aan). Elke witte doos vertegenwoordigt het gebied van de hersenen (medulla oblongata, cerebellaire plaat, optisch tectum, habenula en dorsale telencephalon). (C) Het hele brein gerenderd met behulp van napari. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beeldvorming van neuronale activiteit van een larvale zebravishersenen. (A) Confocale microscopieafbeelding van neuronale activiteit in een larvale zebravis (4 d.p.f.) hersenen die panneuronale GCaMP7a tot expressie brengen. Schaalbalk: 100 μm. (B) Vergrote weergave van het gedooste gebied in A met de neuronale activiteit in het optische tectum op meerdere tijdstippen. Schaalbalk: 20 μm. (C) De 3D-weergave van de neuronale activiteit van de hele hersenen in het larvale zebravisbrein verkregen met behulp van een op maat ontworpen microscoop (links: t = 133 s; rechts: t = 901 s). De neuronale activiteit wordt over de statische achtergrond gelegd. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Time-lapse beeldvorming met en zonder sample drift. (A) Time-lapse beeldvorming van de larvale zebravishersenen die panneuronale GCaMP7a tot expressie brengen met monsterdrift. Eiwater werd aan het monster toegevoegd voordat de agarosegel stolde (stap 3.6-3.7). De vis bewoog in de zijwaartse en axiale richting. (B) Time-lapse beeldvorming van een larvale zebravishersenen zonder monsterdrift. Eiwater werd aan het monster toegevoegd na stolling van de agarosegel (stap 3.6-3.7). Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: 3D-weergave van de whole-brain structuur van een larvale zebravis (4 d.p.f.) hersenen die pan-neuronale GCaMP7a tot expressie brengen. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: 3D-weergave van neuronale activiteit van de hele hersenen in een larvale zebravis (4 d.p.f.) hersenen die panneuronale GCaMP7a tot expressie brengen. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Het huidige protocol maakt in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen over een langere periode (bijvoorbeeld langer dan 1 uur) en visualisaties van de verkregen structurele en functionele beeldvormingsgegevens mogelijk.
De meest kritische stappen zijn monstermontage en positionering. Tijdens het insluiten van monsters is het cruciaal om bubbelvorming te voorkomen en stof in de agarosegel te voorkomen. Als de gel luchtbellen en stof bevat, kan de beeldkwaliteit ernstig verslechteren. Bij het positioneren van het monster met een tang is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het monster zowel horizontaal als verticaal waterpas staat. Anders mogen de gebieden van belang niet binnen het gezichtsveld van de microscoop worden opgenomen. Bovendien moet deze positionering binnen een kort tijdsbestek vóór het stollen van de agarose-gel worden gedaan om schade aan het oppervlak te voorkomen, omdat dergelijke schade de beeldkwaliteit in gevaar brengt.
Een andere grote uitdaging is het vermijden van beweging in beelden die afkomstig zijn van onvolledige stolling van de agarosegel (figuur 6) en verlamming van de zebravis. Wanneer eiwater aan het monster wordt toegevoegd voordat de agorsegel volledig is gestold, bewegen vissen langzaam zowel lateraal als axiaal en manifesteren zich als monsterdrift in de tijdreeksafbeeldingen (figuur 6A). Als de dosis verlammingen onvoldoende is of de duur van het effect eindigt, kan het monster proberen te bewegen, wat in de time-lapse-beelden als snelle spiertrekkingen verschijnt.
Ondanks het belang van de bovengenoemde stappen voor het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit zonder bewegingsartefacten, bieden openbaar beschikbare protocollen 15,16,17,18,19 slechts een kort overzicht van de experimentele procedure, waarbij deze details ontbreken. De verkregen beelden zonder immobilisatieprotocollen11 lijden bijvoorbeeld aan aanzienlijke bewegingsartefacten die de stroomafwaartse beeldanalyse uitdagend maken. Door essentiële componenten te integreren, zoals agarose-gelstolling en monsterverlamming, verbetert ons protocol de consistentie in de kwaliteit van verkregen afbeeldingen aanzienlijk terwijl bewegingsartefacten worden geminimaliseerd.
Samenvattend wordt een geoptimaliseerde en reproduceerbare experimentele procedure beschreven voor in vivo beeldvorming van het larvale zebravisbrein. De validiteit en reproduceerbaarheid van dit protocol voor in vivo beeldvorming van hersenactiviteit en -structuur zijn bevestigd in meerdere settings 14,18,29,30,31. De huidige workflow richtte zich op de beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen, maar het kan gemakkelijk worden toegepast op het in beeld brengen van andere organen van larvale zebravissen35,36.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
De zebravislijnen die worden gebruikt voor calciumbeeldvorming werden geleverd door het Zebrafish Center for Disease Modeling (ZCDM), Korea. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
| 50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
| Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
| Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
| Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
| Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
| Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
| NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
| Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
| Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
| Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
| Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
| Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |
References
- Choi, T. -Y., Choi, T. -I., Lee, Y. -R., Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Experimental & Molecular Medicine. 53 (3), 310-317 (2021).
- Ahrens, M. B., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Piatkevich, K. D., et al. A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters. Nature Chemical Biology. 14 (4), 352-360 (2018).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Looger, L., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Biorxiv. , (2021).
- Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nature Methods. 10 (5), 413-420 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11 (7), 727-730 (2014).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12 (12), 1171-1178 (2015).
- Ahrens, M. B., Engert, F.
- Yoon, Y. -G., et al. Sparse decomposition light-field microscopy for high speed imaging of neuronal activity. Optica. 7 (10), 1457-1468 (2020).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Cong, L., et al. Rapid whole brain imaging of neural activity in freely behaving larval zebrafish (Danio rerio). eLife. 6, e28158 (2017).
- Bruzzone, M., et al. Whole brain functional recordings at cellular resolution in zebrafish larvae with 3D scanning multiphoton microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 11048 (2021).
- Cho, E. -S., Han, S., Lee, K. -H., Kim, C. -H., Yoon, Y. -G. 3DM: deep decomposition and deconvolution microscopy for rapid neural activity imaging. Optics Express. 29 (20), 32700-32711 (2021).
- Zhang, Z., et al. Imaging volumetric dynamics at high speed in mouse and zebrafish brain with confocal light field microscopy. NatureBiotechnology. 39 (1), 74-83 (2021).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Current Biology. 23 (4), 307-311 (2013).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233 (2), 329-346 (2001).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Morsch, M., et al. Triggering cell stress and death using conventional UV laser confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Parker, M. O., Brock, A. J., Millington, M. E., Brennan, C. H. Behavioral phenotyping of casper mutant and 1-pheny-2-thiourea treated adult zebrafish. Zebrafish. 10 (4), 466-471 (2013).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Han, S., Cho, E. -S., Park, I., Shin, K., Yoon, Y. -G. Efficient neural network approximation of robust PCA for automated analysis of calcium imaging data. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. , Springer International Publishing. 595-604 (2021).
- Shin, C., et al. Three-dimensional fluorescence microscopy through virtual refocusing using a recursive light propagation network. Medical Image Analysis. 82, 102600 (2022).
- Eom, M., et al. Statistically unbiased prediction enables accurate denoising of voltage imaging data. bioRxiv. , (2022).
- Johnston, L., et al. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (81), e51065 (2013).
- Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. Zenodo. , 3555620 (2022).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Voleti, V., et al. Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0. Nature Methods. 16 (10), 1054-1062 (2019).
