메탄올은 망막 전체 마운트 제제 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로 사용할 수 있으며, 이는 망막 신경절 세포의 조사에 유용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막의 투영 뉴런인 망막 신경절 세포(RGC)는 외부 시각 정보를 뇌로 전파합니다. RGC의 병리학 적 변화는 수많은 망막 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 전체 마운트 망막 면역염색은 망막의 발달 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 자주 사용됩니다. 어떤 상황에서는 형질전환 마우스의 샘플과 같은 일부 귀중한 망막 샘플을 RGC의 형태나 수에 영향을 미치지 않고 장기간 보관해야 할 수도 있습니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 결과를 위해서는 효과적인 보존 배지를 사용하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 망막 전체 장착 준비 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로서의 메탄올의 효과를 설명합니다. 간단히 말해서, 분리 과정에서 차가운 메탄올(-20°C)을 망막 표면에 피펫팅하여 조직을 고정하고 투과성을 촉진한 다음 망막을 면역염색하기 전에 차가운 메탄올(-20°C)에 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RGC 조사에 유용하고 실용적인 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 보관 프로토콜을 설명합니다.
서론
망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 망막에 있는 유일한 투영 뉴런으로, 외부 시각 정보를 통합하여 뇌에 전달한다1. 녹내장 및 외상성 시신경병증과 같은 많은 신경퇴행성 질환은 비가역적 손상과 RGC의 손실을 특징으로 한다 2,3. RGC의 형태학적 및 정량적 변화를 분석하는 것은 신경퇴행성 질환이 어떻게 발생하고 진행되는지를 결정하는 중요한 단계입니다 4,5.
간접 면역형광 분석은 단백질 분포 및 세포 계수를 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 실험실에서 망막의 생리학적 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 전체 마운트 망막 면역염색법이 일반적으로 사용됩니다6. 전체 망막에서 RGC 정량화에 사용되는 가장 일반적인 마커는 Brn3a, 다중 스플라이싱을 갖는 RNA 결합 단백질(RBPMS) 등을 포함합니다 7,8
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프로토콜
모든 단계는 달리 지시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 사용된 모든 C57BL/6J 마우스는 우한대학교 동물실험센터에서 입수하였으며, 모든 관련 실험은 우한대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 생쥐의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 눈의 적출 및 고정
- 생쥐를 이산화탄소 질식으로 안락사시키고 이빨이 없는 핀셋을 사용하여 안구를 부드럽게 적출합니다.
- 인산염 완충 식염수(PBS)로 안구를 한 번 헹굽니다.
- 현미경으로 각막에 주사기 바늘로 안구를 뚫습니다(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x-4.5x) 안구로의 고정을 가속화하고 고정 효율을 향상시킵니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 24웰 플레이트로 옮깁니다.
- 안구를 4% PFA에 45분 동안 고정한 다음 1x PBS로 옮겨 과잉 PFA를 즉시 제거합니다(3회 세척, 5분/회).
2. 망막 분리 및 평탄화
- 안구를 유리 슬라이드로 옮기고 해부 현미경(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x....
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결과
해부 후 망막은 편평한 네잎 클로버처럼 보일 것입니다. 이 연구에서는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 메탄올을 첨가한 후 망막이 하얗게 변했습니다(그림 1). 한편, 망막은 부드러움에서 유연하고 평평한 것으로 바뀌었습니다. 다음으로, RGC는 anti-RBPMS8로 라벨링되었습니다. 컨포칼 현미경(접안렌즈: 10x, 대물렌즈: 40x)을 사용하여 전체 마운트 망막(n = 3)에서 4개의 이미지 필드를 촬영했습니다. 메탄올 처리 전과 메탄올에서 12개월 동안 장기간 보존한 후 망막의 시각화된 RGC의 대표적인 모습이 그림 2에 나와 있습니다. 형광 강도는 큰 변화를 나타내지 않았다. 메탄올 보존은 RGC 면역염색에 영향을 미치지 않았다.
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토론
고정은 망막을 보존하기 위한 필수 단계이며, 이는 형태학을 기반으로 한 후속 RGC 조사에 영향을 미칠 수 있습니다. 성공적인 고정은 망막을 고정 매체에 노출시키는 순간 망막의 구조와 상태를 빠르게 포착하며, 이는 추가 분석에 중요합니다. 포름 알데히드는 조직 및 세포 고정 및 보존을위한 가장 일반적인 고정제 중 하나로 간주되어 왔지만, 포름 알데히드만으로는 일부 조사에서 최적의 화학 고정제로 항상 잘 작동하는 것은 아닙니다10,14. 고정제의 종류에 따라 아미노산과 뉴클레오티드를 침전시키고, 단백질을 안정화하며, 세포 형태를 유지하는 능력이 다양하다15. 두 가지 유형의 고정제를 혼합하여 사용함으로써 각각의 강점을 충분히 활용할 수 있습니다16,17. 메탄올은 조직이 신선하게 .......
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공개 사항
저자는 이 연구의 객관성에 영향을 미칠 수 있는 소속, 회원 자격, 자금 또는 재정 보유에 대해 알지 못합니다.
감사의 글
이 작업은 후베이 핵심 연구소 개설 프로젝트(보조금 번호 2021KFY055), 후베이성 자연 과학 재단(보조금 번호 2020CFB240) 및 중앙 대학 기초 연구 기금(보조금 번호 2042020kf0065)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 세포 배양 클러스터 | Costar | 안구 고정 | |
| 24웰 혈구응집 플레이트 | Labedit Company | 배양 항체 | |
| 접착 현미경 슬라이드 | Citotest | 또는 이와 유사한 | |
| 항형광 담금질 장착제 | Servicebio | G1401 | Slow down 형광 담금질 |
| BSA(소 혈청 알부민) | Servicebio | GC305010 | 차단 시약 |
| 컨포칼 현미경 | OLYMPUS | 적용 40x 대물 렌즈 | |
| 곡선 가위 | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | 해부 도구 | |
| 해부 현미경 | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | 해부 도구 |
| 겸자 | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | 해부 도구 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥ 99.5% |
| 매니큐어 | SecheVite | 밀봉제 | |
| 바늘 | 상하이 친절 기업 개발 그룹 Co., Ltd. | 고정 | |
| 가속화 파라포름알데히드 용액 | Servicebio | G1101 | 안구 고정 |
| PBS (인산염 완충 식염수 pH 7.4) | Servicebio | G0002 | 안구 헹굼 |
| 1차 항체: 기니피그 다중 스플라이싱을 통한 항-RNA 결합 단백질(RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | 면역형광용. 1:400 |
| 2차 항체: Cy3 affiniPure 당나귀 항기니피그 IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | 용. 1:400 |
| 스트레이트 가위에서 | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | 해부 도구 |
참고문헌
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A.
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재인쇄 및 허가
