用于体外和体内骨组织工程的脱细胞苹果衍生支架
Summary
在这项研究中，我们详细介绍了植物基生物材料的脱细胞、物理表征、成像和 体内 植入方法，以及支架中细胞接种和分化的方法。所描述的方法允许评估用于骨组织工程应用的植物基生物材料。
Abstract
植物来源的纤维素生物材料已被用于各种组织工程应用。 体内 研究表明，由天然来源的纤维素制成的支架具有显着的生物相容性。此外，这些支架具有与多种组织相关的结构特征，它们促进哺乳动物细胞的侵袭和增殖。最近使用脱细胞苹果蒺菌组织的研究表明，其孔径与小梁骨的孔径相似，并且能够有效支持成骨分化。本研究进一步研究了苹果衍生纤维素支架在骨组织工程（BTE）应用中的潜力，并评估了其 体外 和 体内 力学性能。将 MC3T3-E1 成骨前细胞接种在苹果来源的纤维素支架中，然后评估其成骨潜力和机械性能。碱性磷酸酶和茜素红 S 染色证实了在分化培养基中培养的支架的成骨分化。组织学检查显示整个支架上有广泛的细胞侵袭和矿化。扫描电子显微镜（SEM）显示支架表面有矿物聚集体，能量色散光谱（EDS）证实了磷酸盐和钙元素的存在。然而，尽管细胞分化后杨氏模量显着增加，但仍低于健康骨组织。 体内 研究表明，在大鼠颅骨中植入 8 周后， 脱细胞的苹果衍生支架内的细胞浸润和细胞外基质的沉积。此外，从骨缺损中移除支架所需的力与先前报道的自体颅骨骨折负荷相似。总体而言，这项研究证实了苹果衍生的纤维素是BTE应用的有前途的候选者。然而，其机械性能与健康骨组织之间的差异可能会限制其在低承重情况下的应用。可能需要进行额外的结构重新设计和优化，以增强用于承重应用的苹果衍生纤维素支架的机械性能。
Introduction
由损伤或疾病引起的大骨缺损通常需要生物材料移植物才能完全再生1.目前旨在改善骨组织再生的技术通常使用自体、同种异体、异种或合成移植物2。对于自体骨移植，被认为是修复大骨缺损的“金标准”移植实践，从患者身上提取骨骼。然而，这种移植手术有几个缺点，包括大小和形状限制、组织可用性和采样部位发病率3。此外，自体移植手术容易受到手术部位感染、随后的骨折、取样或重建部位血肿形成以及术后疼痛的影响4.骨组织工程 （BTE） 为传统骨移植方法提供了一种潜在的替代方案5.它结合了结构性生物材料和细胞来构建新的功能性骨组织。在设计用于 BTE 的生物材料时，将大孔结构、促进细胞附着的表面化学以及与天然骨非常相似的机械性能相结合至关重要6.过去的研究表明，BTE 中使用的生物材料的理想孔径和弹性模量分别约为 100-200 μm7 和 0.1-20 GPa，具体取决于接枝位点8。此外，支架的孔隙度和孔隙互连性是影响细胞迁移、营养扩散和血管生成的关键因素8。
BTE在开发和评估各种生物材料作为骨移植物的替代选择方面显示出有希望的结果。其中一些生物材料是骨诱导材料、混合材料和高级水凝胶8.骨诱导材料刺激新形成的骨骼结构的发育。混合材料由合成和/或天然聚合物组成8.先进的水凝胶模仿细胞外基质 （ECM），能够提供必要的生物活性因子来促进骨组织整合8.羟基磷灰石是一种传统材料，由于其成分和生物相容性，是 BTE 的常见选择9.生物活性玻璃是BTE的另一种生物材料，已被证明可以刺激特定的细胞反应以激活成骨所必需的基因10,11。可生物降解的聚合物，包括聚乙醇酸和聚乳酸，也已广泛用于BTE应用12。最后，壳聚糖、几丁质和细菌纤维素等天然或天然衍生的聚合物也显示出令人鼓舞的 BTE13 结果。然而，虽然合成聚合物和天然聚合物都显示出BTE的潜力，但开发具有所需宏观结构的功能支架通常需要广泛的方案。
相反，天然的宏观纤维素结构可以很容易地从不同的植物中衍生出来，我们的研究小组之前证明了来自植物的纤维素基支架对不同组织重建的适用性。事实上，经过简单的表面活性剂处理后，我们利用了植物材料的固有结构，突出了其作为多功能生物材料的潜力14。此外，这些基于纤维素的支架可用于体外哺乳动物细胞培养应用14，具有生物相容性，并支持自发皮下血管形成14,15,16,17。我们的研究小组和其他人都已经证明，这些支架可以根据预期的应用从特定植物中获得 14,15,16,17,18,19,20。例如，在植物茎和叶中观察到的维管结构与在动物组织中发现的结构表现出惊人的相似性19。此外，源自植物的纤维素支架可以很容易地成型并进行表面生化修饰，以实现所需的特性16。在最近的一项研究中，我们在脱细胞过程中掺入了盐缓冲液，从而增强了在体外和体内环境中观察到的细胞附着16。在同一项研究中，我们通过将水凝胶浇注到支架表面，证明了植物来源的纤维素支架在复合生物材料中的适用性。在最近的研究中，植物来源支架的功能化已被证明可以提高其有效性18.例如，Fontana等人（2017）进行的一项研究表明，人真皮成纤维细胞的粘附得到了RGD涂层脱细胞茎的支持，而未涂层的茎则没有表现出相同的能力18。此外，作者还证明，改良的模拟体液可用于人工矿化脱细胞的植物茎。在最近的研究中，我们探索了植物来源的纤维素支架中机械敏感成骨的概念，并评估了它们对 BTE17,20 的潜力。此外，Lee 等人（2019 年）利用植物来源的支架在体外环境中培养骨样组织21。通过对不同植物来源的综合评估，作者确定苹果衍生的支架是人类诱导多能干细胞（hiPSCs）培养和分化的最佳选择。此外，作者提出，苹果衍生支架的结构和机械属性在其是否适合预期用途方面起着关键作用。作为组织工程应用中最早实施的植物衍生支架，苹果衍生支架已被广泛证明具有与人体骨骼惊人相似的结构，特别是在其直径为 100 至 200 μm 的相互连接的孔隙方面14,21。
在本研究中，我们进一步研究了苹果衍生纤维素支架对BTE的潜力，并对其在 体外 和 体内的力学性能进行了分析。尽管已经对苹果衍生支架对 BTE17、20、21 的潜力进行了研究，但其机械性能尚未得到充分研究。结果显示，在分化培养基中培养 4 周的支架中接种的 MC3T3-E1 成骨前细胞具有野生扩散侵袭和成骨分化。这些支架的杨氏模量为192.0±16.6 kPa，显著高于空白支架（无接种细胞的支架）（31.6±4.8 kPa）和在非分化培养基中培养的细胞接种支架（24.1±8.8 kPa）。然而，应该注意的是，健康人体骨组织的杨氏模量通常在小梁骨的 0.1-2 GPa 范围内，皮质骨的 Young 模量通常在 15-20 GPa 的范围内8.然而，在啮齿动物颅骨缺损中植入 8 周后，细胞播种的支架似乎很好地融入了周围的骨骼，正如推出测试中的平均峰值力为 113.6 N ± 18.2 N 所证明的那样，这与先前报道的天然颅骨22 的骨折负荷相似。总体而言，从这项研究中获得的结果显示出巨大的前景，特别是对于非承重应用。然而，苹果衍生的纤维素支架目前不具备必要的机械性能，无法精确匹配植入部位的周围骨组织。因此，需要进一步开发以释放这些支架的全部潜力。
Protocol
Representative Results
Discussion
几项体外和体内研究已经证明了植物来源纤维素的生物相容性及其在组织工程中的潜在用途 14,15,16,18,19,20，更具体地说是用于宿主成骨分化 20,21.本研究的目的是进一步研究苹果衍生的纤维素…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本项目由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）（发现资助）和李嘉诚基金会提供资助。MLL得到了安大略省卓越中心TalentEdge计划的支持，而RJH则得到了NSERC研究生奖学金和安大略省研究生奖学金（OGS）的支持。
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Dental drill | Surgical tool | ||
| Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
| Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
| McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
| Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
| Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
| Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
| Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
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