이 연구에서는 식물 기반 생체 재료의 탈세포화, 물리적 특성화, 이미징 및 생체 내 이식 방법과 스캐폴드의 세포 파종 및 분화 방법을 자세히 설명합니다. 설명된 방법을 통해 뼈 조직 공학 응용 분야를 위한 식물 기반 생체 재료를 평가할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
식물 유래 셀룰로오스 생체 재료는 다양한 조직 공학 응용 분야에 사용되어 왔습니다. 생체 내 연구는 천연 공급원에서 추출한 셀룰로오스로 만든 스캐폴드의 놀라운 생체 적합성을 보여주었습니다. 또한 이러한 지지체는 여러 조직과 관련된 구조적 특성을 가지고 있으며 포유류 세포의 침입 및 증식을 촉진합니다. 탈세포화된 사과 히판티움 조직을 사용한 최근 연구는 공극 크기가 섬유주 뼈의 기공 크기와 유사할 뿐만 아니라 골형성 분화를 효과적으로 지원하는 능력을 입증했습니다. 본 연구는 뼈 조직 공학(BTE) 응용 분야를 위한 사과 유래 셀룰로오스 지지체의 잠재력을 추가로 조사하고 시험관 내 및 생체 내 기계적 특성을 평가했습니다. MC3T3-E1 전골아세포를 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드에 파종한 후 골형성 잠재력과 기계적 특성을 평가했습니다. 알칼리성 포스파타제 및 alizarin red S 염색은 분화 배지에서 배양된 스캐폴드에서 골형성 분화를 확인했습니다. 조직학적 검사는 골격 전체에 걸쳐 광범위한 세포 침입과 광물화를 보여주었습니다. 주사전자현미경(SEM)을 통해 스캐폴드 표면에 광물 응집체가 발견되었고, 에너지 분산 분광법(EDS)을 통해 인산염과 칼슘 원소의 존재가 확인되었습니다. 그러나 세포 분화에 따른 영률(Young's modulus)이 크게 증가했음에도 불구하고 건강한 뼈 조직보다 낮게 유지되었습니다. 생체 내 연구에서는 쥐 calvaria에 8주 동안 이식한 후 탈세포화된 사과 유래 지지체 내에서 세포 침투 및 세포외 기질의 침착을 보여주었습니다. 또한, 뼈 결손에서 지지체를 제거하는 데 필요한 힘은 이전에 보고된 본래 종골골의 골절 하중과 유사했습니다. 전반적으로, 이 연구는 사과에서 추출한 셀룰로오스가 BTE 응용 분야에 유망한 후보임을 확인합니다. 그러나 기계적 특성과 건강한 뼈 조직의 기계적 특성 사이의 비유사성으로 인해 하중이 적은 시나리오에 대한 적용이 제한될 수 있습니다. 하중 지지 응용 분야를 위한 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 기계적 특성을 향상시키기 위해 추가적인 구조적 재설계 및 최적화가 필요할 수 있습니다.
서론
부상이나 질병으로 인한 큰 뼈 결손은 완전한 재생을 위해 생체재료 이식이 필요한 경우가 많습니다1. 뼈 조직 재생을 개선하기 위해 고안된 현재의 기술은 정기적으로 자가 이식편, 동종 이식편, 이종 이식편 또는 합성 이식편을 사용합니다2. 큰 뼈 결함을 복구하기 위한 "황금 표준" 이식 관행으로 간주되는 자가 뼈 이식의 경우 환자로부터 뼈를 추출합니다. 그러나 이 이식 절차에는 크기 및 모양 제한, 조직 가용성, 샘플링 부위 이환율 등 몇 가지 단점이 있습니다3. 또한, 자가 이식술은 수술 부위 감염, 후속 골절, 검체 채취 또는 재건 부위에서의 혈종 형성 및 수술 후 통증에 취약하다4. 뼈 조직 공학(BTE)은 기존의 뼈 이식 방법에 대한 잠재적인 대안을 제공합니다5. 구조적 생체 재료와 세포를 결합하여 새로운 기능적 뼈 조직을 만듭니다. BTE용 생체 재료를 설계할 때 거대 다공성 구조, 세포 부착을 촉진하는 표면 화학 및 천연 뼈와 매우 유사한 기계적 특성을 결합하는 것이 중요합니다6. 과거 연구에 따르면 BTE에 사용되는 생체 재료에....
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프로토콜
실험 프로토콜은 오타와 대학교 동물 보호 위원회(University of Ottawa Animal Care Committee)에서 검토하고 승인했습니다.
1. 비계 준비
- 만돌린 슬라이서를 사용하여 매킨토시 사과(Canada Fancy)를 8mm 두께로 자릅니다. 사과 조각의 히판티움 조직을 5mm x 5mm 정사각형으로 자릅니다.
- 정사각형 샘플을 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)에 2일 동안 넣습니다.
- 탈셀룰라화된 샘플을 탈이온수로 세척하고 실온(RT)에서 100mMCaCl2의 밤새 배양하여 나머지 계면활성제를 제거합니다.
- 샘플(즉, 스캐폴드)을 70% 에탄올로 30분 동안 멸균하고 탈이온수로 세척한 다음 세포 파종 전에 24웰 배양 플레이트에 넣습니다.
2. 세포 배양 및 스캐폴드 파종
- 세포 배양 조건(95% 공기 및 5%CO2의 가습 분위기에서 37°C)에서 10cm 직경의 세포 배양 처리 접시에 MC3T3-E1 Subclone 4 세포를 유지합니다.
- 10% 소 태아 혈....
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결과
공극 크기 측정, 세포 분포 및 체외 광물화(그림 1 및 그림 2)
사과 조직 스캐폴드의 네이티브 세포 구성 요소를 완전히 제거하는 것은 스캐폴드를 SDS 및 CaCl2 로 처리한 후 달성되었습니다(그림 1A). 스캐폴드는 매우 다공성 구조를 나타냈으며, 이는 컨포칼 현미경을 사용하여 확인되었습니다. 이미지의 정량화는 154μm ± 40μm의 평균 공극 크기를 보여주었습니다. 공극 크기 분포는 73μm에서 288μm 사이였습니다. 그러나 대부분의 기공은 100μm에서 200μm 사이였습니다(그림 1C).
분화 배지에서 4주간의 배양 기간을 거친 후, 세포 시드 스캐폴드는 광범위한 백색 광물 침전물을.......
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토론
여러 시험관 내 및 생체 내 연구에서 식물 유래 셀룰로오스의 생체 적합성과 조직 공학에서의 잠재적 사용 14,15,16,18,19,20, 특히 골형성 분화 20,21. 본 연구의 목적은 BTE에 대한 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 잠재력을 추가로 조사하고 시험관 내 및 생체 내에서 이러한 스캐폴드의 기계적 특성을 평가하는 것이었습니다.
시험관 내.......
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공개 사항
이해 상충 진술 : M.L.L, M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. 및 A.P.는 BTE 응용 분야를 위한 식물 유래 셀룰로오스의 사용과 관련하여 오타와 대학교와 Spiderwort Inc.가 제출한 특허 출원에 대한 발명자입니다. M.L.L., R.J.H., C.M.C. 및 A.P.는 Spiderwort Inc.의 재정적 지분을 보유하고 있습니다.
감사의 글
이 프로젝트에 대한 자금은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)(디스커버리 그랜트)와 리카싱 재단(Li Ka Shing Foundation)에서 제공했습니다. MLL은 Ontario Centers of Excellence TalentEdge 프로그램의 지원을 받았으며 RJH는 NSERC 대학원 장학금과 온타리오 대학원 장학금(OGS)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌 | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 알리자린 레드 S | 시그마-알드리치 | A5533 | ARS |
| 아스코르브산 | 시그마-알드리치 | A4403 | 세포 배양 |
| 염화칼슘 | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| 치과 드릴 | 수술 도구 | ||
| 에탄올 | ThermoFisher | 615095000 | |
| 소 태아 혈청 | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| 포르말린 | 시그마-알드리치 | HT501128 | 10% 포르말린 |
| Goldner의 트리크롬 염색 | 시그마-알드리치 | 1.00485 | GTC |
| 헤마톡실린 및 eosin 염색 | Fisher Scientific | NC1470670 | H& E |
| 고속 공진 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | 니콘 | 니콘 Ti-E A1-R | |
| 염산 | 시그마 알드리치 | 258148 | |
| ImageJ 소프트웨어 | 국립 보건 | ||
| 관개 식염수 | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 서브클론 4 셀 | ATCC | CRL-2593 | 골 세포 전 |
| : McIntosh 사과 | 캐나다 팬시 등급 | ||
| 메틸 메타 크릴 레이트 | : 시그마 - 알드리치 | M55909 | 조직 학적 임베딩 |
| : 최소 필수 매체 | : ThermoFisher | M0894 | α -MEM |
| 파라 포름 알데히드 | : Fisher Scientific | O4042 | 4 %; PFA |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Hyclone Laboratories | SV30010 | 세포 배양 |
| 주기적 산 | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| 인산염 완충 식염수 | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; Ca2+ 및 Mg2+ |
| Propidium | iodide Invitrogen | p3566 | |
| 스캐닝 없음 전자 현미경 | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM 및 EDS |
| 슬라이드 스캐너 현미경 | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| 도데실황산나트륨 | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| 메타중아황산나트륨 | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| 인산나트륨 | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley 쥐 | Charles-River Laboratories | 400 | 남성 |
| 봉합사 | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm 직경 |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | 세포 배양 |
| 트윈 | Fisher Scientific | BP337 | |
| 범용 압축 장치 | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | 조직학 |
참고문헌
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Bioma....
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재인쇄 및 허가
