Decellulariserede æbleafledte stilladser til knoglevævsteknik in vitro og in vivo

Summary

I denne undersøgelse beskriver vi metoder til decellularisering, fysisk karakterisering, billeddannelse og in vivo-implantation af plantebaserede biomaterialer samt metoder til cellesåning og differentiering i stilladserne. De beskrevne metoder tillader evaluering af plantebaserede biomaterialer til knoglevævstekniske applikationer.

Abstract

Planteafledte cellulosebiomaterialer er blevet anvendt i forskellige vævstekniske applikationer. In vivo-undersøgelser har vist den bemærkelsesværdige biokompatibilitet af stilladser fremstillet af cellulose afledt af naturlige kilder. Derudover har disse stilladser strukturelle egenskaber, der er relevante for flere væv, og de fremmer invasion og spredning af pattedyrceller. Nyere forskning ved hjælp af decellulariseret æblehypanthiumvæv har vist ligheden mellem dens porestørrelse og trabekulær knogle samt dens evne til effektivt at understøtte osteogen differentiering. Denne undersøgelse undersøgte yderligere potentialet for æbleafledte cellulosestilladser til knoglevævsteknik (BTE) applikationer og evaluerede deres in vitro og in vivo mekaniske egenskaber. MC3T3-E1 preosteoblaster blev podet i æbleafledte cellulosestilladser, der derefter blev vurderet for deres osteogene potentiale og mekaniske egenskaber. Alkalisk fosfatase og alizarinrød S-farvning bekræftede osteogen differentiering i stilladser dyrket i differentieringsmedium. Histologisk undersøgelse viste udbredt celleinvasion og mineralisering på tværs af stilladserne. Scanningelektronmikroskopi (SEM) afslørede mineralaggregater på overfladen af stilladserne, og energidispersiv spektroskopi (EDS) bekræftede tilstedeværelsen af fosfat- og calciumelementer. På trods af en signifikant stigning i Youngs modul efter celledifferentiering forblev det imidlertid lavere end for sundt knoglevæv. In vivo-undersøgelser viste celleinfiltration og aflejring af ekstracellulær matrix i de decellulariserede æbleafledte stilladser efter 8 ugers implantation i rottecalvaria. Desuden svarede den kraft, der kræves for at fjerne stilladserne fra knogledefekten, til den tidligere rapporterede brudbelastning af naturlig calvarial knogle. Samlet set bekræfter denne undersøgelse, at æbleafledt cellulose er en lovende kandidat til BTE-applikationer. Imidlertid kan forskellen mellem dets mekaniske egenskaber og sunde knoglevævs egenskaber begrænse dets anvendelse til scenarier med lav belastning. Yderligere strukturel rekonstruktion og optimering kan være nødvendig for at forbedre de mekaniske egenskaber af æbleafledte cellulosestilladser til bærende applikationer.

Introduction

Store knogledefekter forårsaget af en skade eller sygdom kræver ofte biomaterialetransplantater til fuldstændig regenerering¹. Nuværende teknikker designet til at forbedre knoglevævsregenerering bruger regelmæssigt autologe, allogene, xenogene eller syntetiske transplantater². Til autolog knogletransplantation, der betragtes som “guldstandard” podningspraksis for at reparere store knogledefekter, ekstraheres knogle fra patienten. Denne podningsprocedure har imidlertid flere ulemper, herunder størrelses- og formbegrænsninger, vævstilgængelighed og prøvetagningsstedsmorbiditet³. Desuden er autologe podningsprocedurer modtagelige for infektioner på operationsstedet, efterfølgende brud, hæmatomdannelse på prøveudtagningsstedet eller rekonstrueret sted og postoperativ smerte⁴. Knoglevævsteknik (BTE) tilbyder et potentielt alternativ til konventionelle knogletransplantationsmetoder⁵. Det kombinerer strukturelle biomaterialer og celler til at opbygge nyt funktionelt knoglevæv. Når man designer biomaterialer til BTE, er det afgørende at kombinere en makroporøs struktur, overfladekemi, der fremmer cellebinding, og mekaniske egenskaber, der ligner dem af native bone⁶. Tidligere forskning har vist, at den ideelle porestørrelse og elastiske modul for biomaterialer, der anvendes i BTE, er henholdsvis ca. 100-200 μm⁷ og 0,1-20 GPa afhængigt af podningsstedet⁸. Desuden er stilladsets porøsitet og poresammenkobling kritiske faktorer, der påvirker cellemigration, næringsstofdiffusion og angiogenese⁸.

BTE har vist lovende resultater med forskellige biomaterialer udviklet og evalueret som alternative muligheder for knogletransplantater. Nogle af disse biomaterialer er osteoinduktive materialer, hybridmaterialer og avancerede hydrogeler⁸. Osteoinduktive materialer stimulerer udviklingen af nydannede knoglestrukturer. Hybride materialer består af syntetiske og/eller naturlige polymerer⁸. Avancerede hydrogeler efterligner den ekstracellulære matrix (ECM) og er i stand til at levere de nødvendige bioaktive faktorer for at fremme knoglevævsintegration⁸. Hydroxyapatit er et traditionelt materiale og et almindeligt valg til BTE på grund af dets sammensætning og biokompatibilitet⁹. Bioaktivt glas er en anden type biomateriale til BTE, som har vist sig at stimulere specifikke celleresponser for at aktivere gener, der er nødvendige for osteogenese^10,11. Bionedbrydelige polymerer, herunder poly(glycolsyre) og poly(mælkesyre), er også blevet anvendt i vid udstrækning i BTE-applikationer¹². Endelig har naturlige eller naturligt afledte polymerer som chitosan, chitin og bakteriel cellulose også vist opmuntrende resultater for BTE¹³. Mens både syntetiske og naturlige polymerer viser potentiale for BTE, kræver udviklingen af et funktionelt stillads med den ønskede makrostruktur typisk omfattende protokoller.

Omvendt kan indfødte makroskopiske cellulosestrukturer let udvindes fra forskellige planter, og vores forskergruppe har tidligere demonstreret anvendeligheden af cellulosebaserede stilladser afledt af planter til forskellige vævsrekonstruktioner. Efter en simpel overfladeaktiv behandling udnyttede vi plantematerialets iboende struktur og fremhævede dets potentiale som et alsidigt biomateriale¹⁴. Desuden kan disse cellulosebaserede stilladser anvendes til in vitro pattedyrcellekulturapplikationer¹⁴, er biokompatible og understøtter spontan subkutan vaskularisering 14,15,16,17. Både vores forskningsgruppe og andre har vist, at disse stilladser kan fås fra specifikke anlæg baseret på den tilsigtede anvendelse 14,15,16,17,18,19,20. For eksempel udviser den vaskulære struktur, der observeres i plantestængler og blade, en slående lighed med strukturen, der findes i dyrevæv¹⁹. Derudover kan cellulosestilladser afledt af planter let formes og udsættes for overfladebiokemiske ændringer for at opnå de ønskede egenskaber¹⁶. I en nylig undersøgelse inkorporerede vi en saltbuffer under decellulariseringsprocessen, hvilket førte til forbedret cellebinding observeret både in vitro og in vivo indstillinger¹⁶. I samme undersøgelse demonstrerede vi anvendeligheden af planteafledte cellulosestilladser i kompositbiomaterialer ved at støbe hydrogeler på overfladen af stilladserne. I nyere undersøgelser har funktionalisering af planteafledte stilladser vist sig at forbedre deres effektivitet¹⁸. For eksempel afslørede en undersøgelse foretaget af Fontana et al. (2017), at vedhæftningen af humane dermale fibroblaster blev understøttet af RGD-belagte decellulariserede stængler, mens ikke-coatede stængler ikke udviste samme evne¹⁸. Desuden demonstrerede forfatterne også, at modificeret simuleret kropsvæske kunne udnyttes til kunstigt at mineralisere decellulariserede plantestængler. I nyere undersøgelser undersøgte vi begrebet mekanosensitiv osteogenese i planteafledte cellulosestilladser og vurderede deres potentiale for BTE^17,20. Desuden brugte Lee et al. (2019) planteafledte stilladser til at dyrke knoglelignende væv i en in vitro-indstilling ²¹. Gennem omfattende evalueringer af forskellige plantekilder identificerede forfatterne æbleafledte stilladser som de mest optimale til dyrkning og differentiering af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er). Desuden foreslog forfatterne, at de strukturelle og mekaniske egenskaber ved de æbleafledte stilladser spiller en afgørende rolle for deres egnethed til det tilsigtede formål. Som de første planteafledte stilladser, der blev implementeret i vævstekniske applikationer, har æbleafledte stilladser i vid udstrækning vist sig at have en slående lignende arkitektur som den menneskelige knogle, især med hensyn til deres indbyrdes forbundne porer, der spænder fra 100 til 200 μm i diameter^14,21.

I denne undersøgelse undersøgte vi yderligere potentialet i æbleafledte cellulosestilladser til BTE og gennemførte en analyse af deres mekaniske egenskaber både in vitro og in vivo. Selv om der har været undersøgelser af potentialet i æbleafledte stilladser til BTE 17,20,21, er deres mekaniske egenskaber blevet underundersøgt. Resultaterne viste vild spredning invasion og osteogen differentiering af MC3T3-E1 preosteoblaster podet i stilladser, der blev dyrket i differentieringsmedium i 4 uger. Youngs modul for disse stilladser var 192,0 ± 16,6 kPa, hvilket var signifikant højere end de blanke stilladser (stilladser uden frøede celler) (31,6 ± 4,8 kPa) og de cellefrøede stilladser dyrket i ikke-differentieringsmedium (24,1 ± 8,8 kPa). Det skal dog bemærkes, at Youngs modul for sundt humant knoglevæv typisk ligger inden for intervallet 0,1-2 GPa for trabekulær knogle og ca. 15-20 GPa for kortikal knogle⁸. Ikke desto mindre, efter en 8-ugers implantation i en gnaverkalvarialdefekt, syntes de cellefrøede stilladser at være godt integreret i den omgivende knogle, som demonstreret af en gennemsnitlig topkraft på 113,6 N ± 18,2 N i push-out-tests, hvilket svarer til den tidligere rapporterede brudbelastning af native calvarial knogle²². Samlet set viser resultaterne fra denne undersøgelse betydelige løfter, især for ikke-bærende applikationer. Imidlertid har æbleafledte cellulosestilladser i øjeblikket ikke de nødvendige mekaniske egenskaber til nøjagtigt at matche det omgivende knoglevæv på et implantatsted. Derfor er der behov for yderligere udvikling for at frigøre det fulde potentiale af disse stilladser.

Protocol

De eksperimentelle protokoller blev gennemgået og godkendt af University of Ottawa Animal Care Committee. 1. Forberedelse af stilladser Brug en mandolinskærer til at skære McIntosh-æbler (Canada Fancy) i 8 mm tykke skiver. Skær æbleskivernes hypanthiumvæv i firkanter på 5 mm x 5 mm. Anbring de firkantede prøver i 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) i 2 dage. De decellulariserede prøver vaskes med deioniseret vand og inkuberes natten over ved…

Representative Results

Måling af porestørrelse, cellefordeling og in vitro-mineralisering (figur 1 og figur 2)Fuldstændig fjernelse af indfødte cellulære komponenter i æblevævsstilladserne blev opnået efter behandling af stilladserne med SDS og CaCl2 (figur 1A). Stilladserne udviste en meget porøs struktur, som blev bekræftet ved hjælp af konfokal mikroskopi. Kvantificeringen af billederne viste en genne…

Discussion

Flere in vitro– og in vivo-undersøgelser har vist biokompatibiliteten af planteafledt cellulose og dens potentielle anvendelse i vævsteknik 14,15,16,18,19,20, mere specifikt til hosting af osteogen differentiering ^20,21. Formålet med denne unders?…

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology